7造血干细胞表型及分离纯化方法.ppt

造血干细胞表型 及分离纯化方法 ; 一个多世纪前，由 Artur appenheim(1870~1916)提出。是一类同时具有自我更新和向各系血细胞分化能力的原始细胞群。;支持干细胞存在的初始证据;3.用带有新霉素抗性基因标志的逆转 录病毒载体转染鼠骨髓细胞，分析 病毒特异聚集部位证实，不同淋巴 和髓系表型的细胞来自同一干细 胞。 4.鼠胎肝造血祖细胞体外单细胞培养 可生成髓系和粒系细胞。; 缺乏辨认、计数干细胞的手段。干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估??如：CFU-GM ，CFU- Mix。Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗(My-10), 当时称KG-la,该抗体可与所有造血前体细胞(progenitors)特异结合。; 之后，其他研究小组也相继研制出12.8; BI-3c5; ICH-3等类似抗体。1986年，这些抗体被命名为CD34，为目前公认的干细胞的重要标志。 CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展，是一重要的里程碑事件。;一.造血细胞的表型 CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；c-kit 二.造血细胞分离方法 FACS；磁柱分离；亲合分离； Panning;一、造血干细胞表型;1.CD34的生物学特性; 全长(spans)26~28kb (human), 编码序列含8个exons ， 第1和8个exon 编码翻译区和部分非翻译区； 2~7个exons仅编码翻译区。也有报道人CD34基因全长38kb 。; 在 cytoplasmic domains,人、鼠CD34基因的同源性达90%以上。这种同源性在N末端逐渐减少为45%左右。; 分子量为105-120kd。人CD34 cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基，是一跨膜蛋白。; N端为20aa的信号肽，含有大量的 serine / threonine；胞外区258aa；跨膜区22aa；胞内区73aa。; 所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10, BI-3c5, 12.8, ICH-3, TUK , 115.2 等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于 sialic acid residues, 后二者却不 一样。 ; （根据对neuraminidase和glycopotease 的敏感性不同）;;; 此外，淋巴内皮小静脉粘附实验表明，由重组L-selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列与CD34一致，因此，CD34分子至少可作为L-selectin的配体，协助干细胞与基质细胞接触和粘附。; 干细胞越原始，表面CD34分子密度越大，细胞分化到形态学发生改变时，表面CD34分子表达逐渐减少，直至消失。 推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。; Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。; 外周血单核细胞约为0.1% 破骨细胞(osteoclasts)、骨髓基质前体 细胞、外周神经鞘细胞、成纤维细胞、 血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表 达。 骨髓单核细胞约为1~3%。; 一些恶性疾病，如AML、早前，前和急性T淋巴细胞白血病细胞都有CD34抗原的表达。在成人AML中，外周细胞CD34的表达预示患者对系统治疗反应较差，完全缓解率及存活率低，传统的化疗方案治疗效果可能不好。; 根据细胞表面抗原表达的情况，可将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细胞多数已定向到特定细胞系。 与CD34共表达，可作为干细胞进一步分型依据的抗原有：CD38、CD10、CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、CD41、CD13、CD33等。;不同CD34阳性细胞亚群;CD34hi Lin- HLA-DRlow Thy-1+ CD45RO+ Rhodull …………..; CD34+CD38- HLA-DR+ 和CD34+CD38-HLA-DR-两群细胞，前者克隆率为50%，能向所有造血细胞系分化；后者除前者功能外，还能形成复杂的，能支持造血前体细胞分化的基质结构，这种细胞 被命名为Common (hematopoietic/stromal) Stem Cell (CSC)。; Osawa等