细胞与遗传学实验设计.docx

13级临床八年制 赵奕凯细胞与遗传学实验设计 赵奕凯已知： （1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用； （2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。 试通过设计细胞生物学实验明确： （1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系如何？ （2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 一、实验目的 1．探究B 基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系。 2．明确在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 二、实验原理 1．A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用。 2．心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。 3．设计三组心肌细胞，一组为正常对照，一组为缺血损伤组，一组为药物A保护组。通过合适的方法检测三组心肌细胞B基因表达产物B蛋白的表达量，用CCK-8比色法检测间接反映活细胞数量和缺血损伤情况。 4． CCK-8测定细胞活力：试剂中的WST-8，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy?PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan）。生成甲瓒的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。光吸收值越小，活细胞越少，心肌细胞缺血受损越严重。 三、实验器材与试剂 动物：出生1~4天的Wistar大鼠 仪器：二氧化碳培养箱、酶标仪、移液枪、枪头、滴管、显微镜、湿盒、96孔板、常见动物手术器械 试剂：胰蛋白酶、DMEM培养液（10%小牛血清）、培养基、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、无糖Hank’s液（成分：8.0g/L NaCl、0.4g/L KCl、0.14g/L CaCl2、0.2g/L MgSO4·7H2O、1.2g/L Na2HPO4·I2H2O、0.08g/L KH2PO4， pH7.2～7.4）、CCK-8工作液（原液：无血清高糖DMEM=1:10） 四、实验操作 1．心肌细胞的获得与培养： 新生乳鼠无菌条件下开胸取心，剪碎，胰蛋白酶消化成单细胞，用含DMEM培养液、青霉素、链霉素的培养基制成心肌细胞悬液，接种于玻璃培养瓶，37°C下密闭静置培养3天。 心肌细胞的分组与处理方法： 将心肌细胞接种于I、II、III三个96孔板，每个板接种6孔。I板为对照组、II板为缺血不给药组，III板为缺血给药组。 ①对照组（I板）：先用移液枪向6个孔中加入适当剂量的生理盐水置于37°C，95%O2+5%CO2二氧化碳培养箱中，并用DMEM培养液正常培养3h。 ②缺血不给药组（II板）：先用移液枪向6个孔中加入适当剂量的生理盐水，再置于37°C，95%N2+5%CO2二氧化碳培养箱中，并用无糖Hank’s溶液培养3h。 ③缺血给药组（III板）：先用移液枪向6个孔中加入与II板同等剂量的A药物，再置于37°C，95%N2+5%CO2二氧化碳培养箱中，并用无糖Hank’s溶液培养3h。 3．心肌细胞B蛋白的检测 每块板中确定3孔细胞，用适合B蛋白检测的方法测定其中B蛋白的含量。（比如免疫组化法） 4．CCK-8比色法测定细胞活力 吸弃每块板中剩下3孔的培养液，加入适量CCK-8工作液培养1h，用酶标仪在450nm波长处进行比色，测定吸光度。 五、实验结果和讨论 预计会出现的实验结果： 对照组和缺血不给药组对比： ①CCK-8活力测定结果：A（缺血不给药组）＜A（对照组）。 ②B蛋白检测结果： 由于心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白含量会发生改变，所以测定的对照组和缺血不给药组和的B蛋白含量会不同。可能出现以下两种情况： 若缺血不给药组B蛋白含量少于对照组，则说明心肌细胞缺血时B基因表达能力下降，表达产物减少； 若缺血不给药组B蛋白含量多于对照组，则说明心肌细胞缺血时B基因表达能力提高，表达产物增加。 缺血不给药组和缺血给药组对比： ①CCK-8活力测定结果：A（缺血不给药组）＜A（缺血给药组）。（因为A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤作用） ②B蛋白检测结果： 若缺血不给药组的B蛋白含量和缺血给药组的B蛋白含量无明显差异，则说明B基因的表达产物不参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程； 若缺血不给药组的B蛋白含量多于缺血给药组的B蛋白含量，说明B基因的表达产物参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程，且A药物可能会抑制B基因的表达； 若缺血不给药组的B蛋白含量少于缺血给药组的B蛋白含量，说明B基因的表达产物参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程，且A药物可能会加强B基因的表达。 对照组和缺血给药组对比： ①CCK-8活力测定结果：A（缺血给药组）＜