学号 13301050196 姓名 刘忠和 班级 13级临八2班 指导老师 李锦燕.docx

学号 姓名 刘忠和 班级 13级临八2班 指导老师 李锦燕 实验设计内容和要求 已知： （1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用； （2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变 试通过设计细胞生物学实验明确： （1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？ （2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否 参与其中？ 背景：心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。冠心病是引起心肌缺血最主要、最常见的病因。 随着人民生活水平的提高，目前心肌缺血在我国的患病率呈逐年上升的趋势。心肌缺血是中老年人的常见病和多发病。 实验思路 对于第一个问题，要从基因表达产物与心肌缺血间影响的充分性与必要性两个方面去证明，去探究验证是B基因表达产物影响了心肌缺血，还是心肌缺血导致B蛋白表达量改变。第一种方法对比正常细胞与B基因敲除细胞的心肌缺血情况，第二种方法对比正常细胞与心肌缺血细胞的B基因蛋白表达量。 对于第二个问题，方法一是实验组使用siRNA沉默B基因表达，质粒转染使B基因过表达后，对照A药物治疗普通缺血细胞心肌缺血的效果。方法二是在无处理缺血损伤组与A药物处理缺血损伤组中比较B基因表达水平。 实验理论背景 siRNA沉默基因 Small interfering RNA (siRNA):是一种小RNA分子(~21-25核苷酸)，由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。 RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象 Western Blot 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 免疫组化 免疫组化包括四种方法，免疫荧光法是利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。 免疫酶标法基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。 免疫胶体金法用胶体金标记抗体作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。 免疫铁蛋白法以铁蛋白标记抗体，铁蛋白含有2000―3000个铁原子的致密铁离子核心，形成四个圆形致密区，所以，具有较高的电子密度，易于电镜观察。 一，验证B基因表达产物影响心肌缺血 实验设计 B基因siRNA转染组 空白对照组一 心肌缺血模型组（不转染，缺血时间分为1h，2h，3h） 空白对照组二 检测B基因siRNA转染组与空白对照组一中乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶（CK）水平 Western Blot检测心肌缺血模型组（不转染）与空白对照组二B蛋白表达 实验过程 1 制备成年大鼠心肌细胞 取出生1~3d大鼠1若干只，无菌条件下开胸取出心脏，放入4℃D-Hanks缓冲液清洗，在冰上，将心脏剪成1mm*1mm*1mm的组织块，用0.08%胰蛋白酶和0.1%胶原酶交替消化，消化时置于37℃水浴磁力搅拌器上，每次8min。消化完成后，将上层液体转至10ml离心管中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和，1000rpm离心5min，去上清，用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，保存于37℃CO2培养箱。将心肌组织分次消化收集，最后将收集的细胞悬液用200目滤网过滤，将过滤后的细胞悬液置于培养皿中，于5%二氧化碳、37℃培养箱中贴壁2h。收集未贴壁的细胞悬液，计数细胞，调整至5~6*105每毫升，加入0.1mmol/LBrdU，吹打后接种于35mm培养皿（2ml/皿），接种后48h首次换液，继续加入0.1mmol/LBrdU，心肌细胞培养5d。 2 siRNA转染制备B基因siRNA转染组 1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50% (不同细胞生长速度不一