实验设计 13301050232 罗翔.docx

13301050232 罗翔 13临床医学（八年制） 实验设计 已知：（1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用；（2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变 试通过设计细胞生物学实验明确（1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？（2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 实验目的：1）明确B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系 2）B基因的表达产物与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的联系 实验原理： 1）利用SABC技术我们可以在细胞或组织中观察到目的抗原的分布情况和大致含量情况（本实验中为B基因的表达产物B蛋白），通过损伤前和损伤后的细胞进行B蛋白的检测我们可以确定B蛋白与心肌细胞缺血之间的联系，若观察到B蛋白在损伤前后数量增多，则可以说明B蛋白可能具有抑制损伤的作用，而若减少则说明B基因表达产物与心肌细胞缺血损伤之间关系不明。 2）同样利用SABC技术进行对于B基因表达产物情况的检测。若观察到加入A药物后B基因表达产物有变化，则说明B蛋白参与其中：若在A药物加入后观测到B基因表达产物的增多，则可以表明A药物可能通过增加B基因的表达来保护心肌细胞免受缺血损伤;若在A药物加入后观测到B基因表达产物量变化不大，则可以表明可能A药物保护心肌细胞的过程中，B基因表达产物并未参与其中；若减少，则说明A药物可能通过抑制B表达保护心肌细胞免受缺血损伤。 3）若有必要，可通过CCK-8法对细胞所受损伤情况进行染色观察，本实验中未知心肌损伤程度，引起大量凋亡可以通过凋亡情况的观察反应损伤情况，否则CCK-8法则有助于对细胞活力的鉴定。 实验仪器及试剂： 试剂：A药物（一定浓度溶解）、甲醇、PBS、封闭液、特异性抗体、生物素标记的二抗、SABC、DAB 、0.3％H2O2-PBS、DMEM培养液。 材料：培养心肌细胞（可从培养大鼠处取样，并建立相应模型，具体方法步骤在此不赘述） 仪器：96孔板、移液枪、枪头、滴管、显微镜、湿盒、水浴箱、刻度离心管、培养箱等 实验步骤： I 1.正常心肌细胞在96孔板中进行培养后取样以SABC技术进行B蛋白的观察，并记录保存图片。 (吸弃培养液，PBS洗，3次 (轻轻摇动后吸弃，小心),甲醇固定5min,PBS洗，3次（同上）,加入封闭液，37 ℃，30-60min，吸去上清液（每组5孔）,加一抗，37 ℃，1-2h后置4℃冰箱过夜,PBS洗，3次,加二抗，37 ℃，1-2h,PBS洗，3次, 加0.3％ H2O2-PBS，37 ℃，30min,PBS洗，3次,SABC工作液（即用型），37 ℃，30min,PBS洗，3次,用三蒸水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加至96孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。镜检) 2.组织对照在96孔板中进行缺血损伤处理和正常两组多孔培养。 3.分别各组取样同样以SABC技术进行B蛋白的观察，并记录保存图片。 注：分组中培养孔数量根据实验条件设置，可设置较多以减小各种可能的实验误差。 II1.正常心肌细胞在96孔板中进行培养后取样以SABC技术进行B蛋白的观察，并记录保存图片。 2.设计五组于96孔板内进行多孔分组培养，分别为缺血损伤，正常以及三个浓度梯度的药物加入组。 3．分别各组取样同样以SABC技术进行B蛋白的观察，并记录保存图片。 III 对比分析