实验设计-李中阳.docx

MED130062.01细胞与医学遗传学实验李中阳 临床医学（八年制） 实验一：探究B基因的表达产物与心肌细胞缺血之间的关系 实验试剂：D-Hank’s液，0.0625%胰酶，10%胎牛血清DMEM培养液（含糖、无糖），Brdu，B基因抑制剂，PBS（磷酸盐缓冲液，0.01M，PH7.2），甲醇，封闭液（5% 牛血清白蛋白BSA，即用型），一抗（小鼠IgG，用时PBS1:300稀释），二抗（生物素化山羊抗小鼠IgG），SABC（链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物），DAB显色液试剂盒（3,3′-二氨基联苯胺、TBS、 H2O2），蒸馏水，CCK-8工作液（原液：无血清高糖DMEM =1:10） 实验器材：超净工作台，手术器械，恒温磁力搅拌器，移液枪，枪头，低速自动平衡离心机，CO2培养箱，96孔细胞培养板，滴管，倒置显微镜，湿盒，酶标仪 实验步骤： 1.大鼠心肌细胞原代培养：乳鼠无菌开胸取心尖，预冷D-Hank’s液洗3次，剪成1mm3大小； 37℃恒温磁力搅拌器中0.0625%胰酶多次消化8min，第一次消化后自然沉淀弃上清，之后自然沉淀取上清；每次分离的上清液加等量含10%胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1000r/min离心10min，重复3次；细胞悬液放37℃CO2培养箱培养90min后采用差速贴壁分离技术吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/ml，将单细胞悬液接种于培养板中，前3d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液，以后隔日换液。 2.建立心肌细胞缺血模型：按培养液类型和是否加入B基因抑制剂将心肌细胞分成8组：空白对照，抑制剂对照，1h缺血损伤，1h缺血损伤+抑制剂，2h缺血损伤，2h缺血损伤+抑制剂，3h缺血损伤，3h缺血损伤+抑制剂，缺血损伤组吸弃含糖培养液加入无糖培养液，抑制剂组吸弃原培养液后分别加入B基因抑制剂；37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每小时取出相应培养时间的缺血损伤组和抑制剂组进行实验。 3. 免疫组化法测定B蛋白表达量：在96孔板上每组各取2孔，吸弃培养液，PBS洗3次；甲醇固定5min，PBS洗3次；加入封闭液25μl，37 ℃，30-60min，吸去上清液；加一抗25μl，37 ℃，1-2h后置4℃冰箱过夜，PBS洗3次；加二抗25μl，37 ℃，1-2h，PBS洗3次；加0.3％ H2O2-PBS（30-50μl），37 ℃，30min，PBS洗3次；SABC工作液（即用型）25μl，37 ℃，30min，PBS洗3次；：用三蒸水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加至96孔板（25μl/孔），镜下控制，以蒸馏水终止反应；观察结果。 4.细胞活力测定：接种细胞于96孔板，每组3孔，每孔加200ul培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养；测定前吸弃原培养液，每孔加110ul CCK-8 工作液，继续培养；CCK-8 作用1h用酶标仪在450nm波长处比色，测定吸光度。 实验结果：若空白对照、1h缺血损伤、2h缺血损伤、3h缺血损伤四组DAB染色逐渐加深，相同培养时间的两组CCK-8法比色抑制剂组吸光度较小，说明B基因表达随心肌细胞缺血时间延长而增加，抑制B基因表达加快细胞凋亡，证明B基因表达产物参与心肌细胞抗缺血损伤；若空白对照、1h缺血损伤、2h缺血损伤、3h缺血损伤四组DAB染色逐渐加深，相同培养时间的两组CCK-8法比色抑制剂组吸光度较大，说明B基因表达随心肌细胞缺血时间延长而增加，抑制B基因表达延缓细胞凋亡，证明B基因表达产物参与心肌细胞凋亡调控；若空白对照、1h缺血损伤、2h缺血损伤、3h缺血损伤四组DAB染色逐渐变浅，相同培养时间的两组CCK-8法比色抑制剂组吸光度无显著差异，说明B基因表达随心肌细胞缺血时间延长而减少，抑制B基因表达与细胞凋亡速度无关，证明B基因表达产物不直接参与心肌细胞缺血应答，是其他生化反应的产物。 实验二：探究B基因表达产物是否参与A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程 实验试剂：除增加A药物外同实验一 实验器材：同实验一 实验步骤： 1.大鼠心肌细胞原代培养：同实验一。 2.建立心肌细胞缺血模型：按是否加入A药物和是否加入B基因抑制剂将心肌细胞分为四组：空白对照、仅药物、仅抑制剂、药物+抑制剂，每组均吸弃含糖培养液加入无糖培养液，仅药物组吸弃原培养液后加入A药物，仅抑制剂组吸弃原培养液后加入B基因抑制剂，药物+抑制剂组吸弃原培养液后加入A药物和B基因抑制剂；37℃、5%CO2、饱和湿度下培养2h。 3.B蛋白表达量测定和细胞活力测定：同实验一。 实验结果：若CCK-8法比色仅抑制剂组吸光度最小，仅药物组吸光度最大，空白对照组和药物+抑制剂组介于二者之间，药物+