实验设计 包丽莲13301050244 .docx

PAGE6 / NUMPAGES6 细胞与医学遗传学实验 实验设计 实验名称：B基因表达产物与心肌细胞缺血损伤的关系及B基因表达产物与A药物保护心肌细胞的关系 选课代码： MED130062.01 姓名： 包丽莲 专业： 2013级临床医学（八年制）2班 学号： 班级： 单周 周二下午6-9 关于B基因表达产物与心肌细胞缺血损伤之间的关系及Ａ药物与Ｂ基因表达产物相互作用的实验 实验目的 已知A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用，且心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。 本实验通过设计实验来证明： （1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血之间的关系。 （2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 实验原理 （1）体外模拟心肌细胞缺血模型 建立体外心肌细胞缺血模型，能够使我们从细胞水平来研究心肌细胞缺血过程中，发生的改变与反应。取小鼠的心肌细胞并进行培养，以缺血液（无糖）及高纯氮气（95%N2、CO2）持续通气，来建立心肌细胞的缺血模型。 （2）免疫细胞化学技术 免疫细胞化学（immunocytochemistry）即将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，再用标记了生物素、荧光素等的二抗结合一抗，二抗再与标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（链酶亲和素等）结合，最后通过显色反应或荧光反应来显示细胞中的抗原。在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，籍此对细胞内某抗原作定性、定位以及定量检测。 链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术（SABC技术）：利用链霉亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶，其对生物素分子亲和力极高，对组织和细胞的非特异吸附很低，因此该方法背景很低。 DAB显色：HRP + H2O2＝＝HRP ·H2O2 （HRP：辣根过氧化物酶） HRP ·H2O2 + DH2 → HRP + D + 2H2O （DAB：3,3-二氨基联苯胺） 产物为棕黄色 （3）CCK-8比色法细胞活力测定 CCK-8试剂中含有WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐），它在电子载体1-Methoxy PMS（1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯）的作用下，被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒，且生成甲瓒的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 器材与试剂 材料：小鼠 仪器：96孔细胞培养板、酶标仪、移液枪、枪头、滴管、显微镜、解剖刀、镊子、离心机、离心管、缺氧培养箱 试剂：缺血液、甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3% H2O2-PBS、DMEM培养液、II型胶原酶、透明质酸酶、A药物、CCK-8工作液（原液：无血清高糖DMEM＝1:10） 模拟缺血液：NaCl 118mmol/L，NaHCO3 24mmol/L，KCl 16mmol/L，KH2PO4 1.0mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，MgCl2 1.2mmol/L，Na-EDTA 0.5mmol/L，乳酸钠 20mmol/L，将PH调为6.2，置于4°C冻存。 PBS：磷酸盐缓冲液（0.01M，PH7.2） 封闭液：5% 牛血清白蛋白（BSA，即用型） 一抗：小鼠IgG（抗小鼠、抗大鼠、抗人），用时PBS稀释（1:300） 二抗：山羊抗小鼠IgG(生物素化) SABC(avidin-biotin-peroxidase complex)：链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物 DAB(diaminobenzidine)显色液试剂盒：3,3′-二氨基联苯胺、TBS、H2O2 实验步骤 B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系 心肌细胞培养：取小鼠10只，处死，取出心脏，用PBS清洗3～4次，去心包膜及心房。将心室剪碎至1mm3左右的颗粒，加入5ml透明质酸酶-II型胶原酶混合酶，于37°C消化20min，轻轻吹打，静置1min后收集上清液，加入DMEM培养液终止消化。过滤，离心并弃上清液，加入4ml培养液吹打成细胞悬液，接种于四个不同的96孔板（分别为对照组、缺血1h、2h、4h），每组3孔，37°C、5%CO2孵箱中培养，每24h换液一次。培养至第5天的细