实验设计 王凯 13301050240.docx

王凯 实验设计 已知： （1）A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用； （2）心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变 实验目的： （1）B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？ （2）在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 实验器材： 棉球、剪子、镊子、玻璃离心管、培养皿、玻璃吸管、移液枪、枪头、显微镜、湿盒、96孔板、酶标仪、过滤除菌的D-Hanks液、含不同浓度胎牛血清的DMEM、不含EDTA的0.125%胰酶、0.08%的胶原酶II、75%酒精、甲醇、PBS、封闭液(5%BSA)、一抗(Bax6A7，用时PBS以1:300稀释)、二抗(生物素山羊抗小鼠IgG)、SABC、DAB、0.3％H2O2-PBS、CCK8检测试剂盒、药物A等。 实验方法： 一．提取并培养大鼠心肌细胞 1.取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织； 2.更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次； 3.去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清； 4.再加5ml左右消化液，37℃消化20min，用吸管吹打1min 后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000 rpm 5min，弃上清； 5.沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液； 6.上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中，二氧化碳培养箱中（37℃，5%CO2）。 二．构建心肌细胞缺血模型 1.接种5×104/ml大鼠心肌细胞于96孔板，每孔200ul培养液，分为六组，每组四个平行孔；37℃、5%CO2培养； 2. 24h后，吸弃原培养液，按下表加入培养液继续培养： 正常组 缺血1组 缺血2组 缺血3组 药物A1组 药物A2组 1行 含10%胎牛血清的DMEM 不含胎牛血清的DMEM 含3%胎牛血清的DMEM 含6%胎牛血清的DMEM 含10%胎牛血清的DMEM，适量药物A 不含胎牛血清的DMEM，适量药物A 2行 含10%胎牛血清的DMEM 不含胎牛血清的DMEM 含3%胎牛血清的DMEM 含6%胎牛血清的DMEM 含10%胎牛血清的DMEM，适量药物A 不含胎牛血清的DMEM，适量药物A 3行 含10%胎牛血清的DMEM 不含胎牛血清的DMEM 含3%胎牛血清的DMEM 含6%胎牛血清的DMEM 含10%胎牛血清的DMEM，适量药物A 不含胎牛血清的DMEM，适量药物A 4行 含10%胎牛血清的DMEM 不含胎牛血清的DMEM 含3%胎牛血清的DMEM 含6%胎牛血清的DMEM 含10%胎牛血清的DMEM，适量药物A 不含胎牛血清的DMEM，适量药物A 三．对1、2行进行免疫组化法测B蛋白表达量 1.PBS洗2次，3min/次，甲醇固定6min； 2.PBS洗3次，3min/次，加入25μl封闭液，37 ℃静置30min； 3.吸弃上清液，加25μl一抗，37 ℃静置1～2h，4℃过夜； 4.PBS洗3次，3min/次，加25μl二抗，37 ℃静置1h以上； 5.PBS洗3次，3min/次，加0.3％ H2O2-PBS，37 ℃静置30min； 6.PBS洗3次，3min/次，加25μlSABC工作液，37 ℃静置30min； 7.PBS洗3次，3min/次，加DAB显色液25ul，镜下控制，蒸馏水终止反应，观察结果。 四．对3、4行进行CCK-8法检测细胞活性 1.吸弃原培养液，加含CCK8试剂的对应血清培养1h； 2.酶标仪450nm波长处测定吸光度。 实验结果假设分析： 一．B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系？ 比较缺血1组、缺血2组、缺血3组与正常组免疫组化法观测到的B蛋白表达量和细胞活性，可能会出现以下两种情况： 1.B蛋白表达量与缺血损伤有关（B蛋白表达量与缺血损伤程度呈正相关或负相关）； 正常组数据最大（或最小），缺血1组、缺血2组和缺血3组的数据呈梯度变化。 2.B蛋白表达量与缺血损伤无关。 四组数据之间无明显差异。 二．在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中？ 比较正常组、缺血1组、药物A1组与药物A2组免疫组化法观测到的B蛋白表达量和细胞活性，可能会出现以下两种情况： 1.在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物参与其中； 正常组与药物A1组数