细胞培养研究生实习课韩汶延.pptxVIP

细胞培养  技术;细胞培养技术 －在现代医学和生物科学研究中应用广泛;第一节 细胞培养的基本知识;细胞培养cell culture（组织培养 tissue culture）概念;细胞培养的目的与用途;对细胞（组织）培养的评价;体内、外细胞的差异;培养细胞的类型及其特点; 成纤维细胞;;培养细胞的增殖过程;培养细胞的生命期;Hayflick极限;培养细胞一代的增殖过程;第二节 细胞生存环境、条件和代谢;;(二)温度： 人哺乳动物：36.5℃±0.5℃; 鸟类：38.5℃; 一般培养细胞对低温的耐受力比高温强，温度上升不超过39℃时,细胞代谢强度与温度成正比。 39～40℃ 1小时,受损伤的细胞可能恢复； 41～42℃ 1小时,严重损伤,个别细胞恢复； 43℃以上1小时，细胞全部死亡。;温度不低于0℃时,细胞代谢有影响,无伤害作用; 置于 25～35℃，细胞能生存，但生长速度减慢； 放在 4℃ 数小时,再放回 37℃ 细胞仍继续生长。 细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时, 细胞因胞质结冰受损而死亡。 ; (三)气体环境 气体：氧气和二氧化碳 氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。 氧气分压1995～89975Pa,适用于封闭式单层细胞培养; 开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。;（四）细胞生存所需基本物质 与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。 ; 细胞耐酸比耐碱性大一些,在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒，而在偏酸性环境中更有利于细胞生长。为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸盐缓冲剂方法，如PBS、Hanks平衡液等。 ;1、糖 是合成某些氨基酸的原料； 经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪； 经过糖解磷酸通路能合成核酸。 各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力, 其中葡萄糖最强,半乳糖最低。 ;2. 氨基酸： 12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。 ;需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。这些维生素在常用培养基中已成为固定组成。 脂溶性维生素对细胞生长也有作用,一般从血清中得到补充。 ;3.促生长因子： 培养液除营养成分外，也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。 胰岛素(1-10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基酸； 氢化可的松(10-8-10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率； 雌激素和雄激素，或使用黄体酮和氢化可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。 血清 是提供生长因子和其细胞所需物质的来源。目前血清、各种组织和其它生物成分，用生物工程的方法提取并商品化。 ; 4.? 其它物质： 在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰等。 需要促细胞粘附物质其，作用是：有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上生长。 ;5.人工培养基： 细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供给细胞营养和保证细胞生长的物质。 培养基的种类分为半固体和液??培养基两类。 液体培养基：分为合成、天然和无血清培养基三种。 ;A．合成培养基： 成分清楚,通过调节各种成分的数量和种类,再借观察细胞生物状况反应性变化,测定细胞与外界环境的适应能力。借以了解细胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。 合成培养基在应用上广泛。 ;B．天然培养基： 用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。 加入5％血清：维持细胞不死或缓慢生长； 加入10％～20％血清：细胞增殖生长。 ;血清的主要作用;血清存在的问题;C.无血清培养基： 培养基内加入促细胞生长因子，当前发现各种促细胞生长因子已达几十种。还有三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗提物。 具有促进细胞生长增殖的作用。 ;第三节 细胞培养的基本技术;一、细胞分离;细胞分离步骤;二、培养细胞的传代 (subculture);细胞消化步骤;细胞系的维持 ;培养细胞观察;细胞冻存的原理 ;细胞冻存步骤;细胞复苏的方法 ;细胞复苏步骤;细胞的运输 ;微生物污