霍乱弧菌脂多糖0抗原基因在大肠.PDF

遗 传学报， 19(4):378- 通ctaG0eneticaSinica 霍乱弧菌脂多糖0抗原基因在大肠 杆菌中的克隆及表达 黄 弘进 马清钧 （中国军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850) 经典生物型及埃尔托生物型霍乱弧菌的染色体 DNA片段分别与载体质粒 PUC18,B.S (M13+）进行克隆，从克隆株中筛选到能表达霍乱弧菌脂多糖O抗原基因的重组子。它们所 表达的脂多糖O抗原具有很好的抗原性及免疫原性，其重组质粒pMG-301,PMG-302经酶切 分析表明，外源片段大小分别为8.4kb,7.6kb，较文献 〔’‘“’报道的 16kb要小，而且基因 结构之间也存在很大差异。 关键词 霍乱弧菌，脂多糖，基因的克隆与表达 烈性传染病霍乱的发病是由霍乱弧菌引起的。霍乱弧菌是非侵袭性病原体，它定居 粘附于小肠，繁殖产生霍乱毒素，导致腹泻。对霍乱免疫的保护性抗原主要为菌体抗原和 毒素的B亚单位抗原 “0,11]。一些研究报道认为在免疫机制中抗菌体免疫将起主要作用，而 菌体的保护性抗原主要为脂多糖的O抗原7.〔13,231，本文以霍乱弧菌的经典型与埃尔托型的 两个代表株569B和178为材料，获得能表达霍乱弧菌脂多糖O抗原的基因克隆，其大小 分别为8.4kb和7.6kb，经验证，其表达的霍乱弧菌的O抗原是特异的，具有良好的抗原 性与免疫原性。 材 料 和 方 法 一（）材料 1.菌株 1（)霍乱弧菌178埃（尔托生物型，小川血清型）：由卫生部药品生物制 品检定所提供。(2)霍乱弧菌569B经（典生物型，稻叶血清型）：由卫生部药品生物制品 检定所提供。(3）大肠杆菌K-12,HB101(F一、r8m$,recA-,ara--14,proA2,lacY,, ga1K2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,supE44,I一）为本实验室保存菌株。 2．抗血清 （1)霍乱弧菌O多价抗血清： 由卫生部药品生物制品检定所提供。 (2)霍乱弧菌569B抗血清：本实验室免疫家兔获得。琼脂糖扩散测定其效价为 1:32, 0）霍乱弧菌单克隆抗血清：由浙江省医学科学院微生物所馈赠。(4）辣根过氧化物酶 标记的羊抗兔血清：卫生部北京生物制品研究所产品。 3。实验动物： (1)上海小白鼠：16--18克，本院动物中心提供。(2）家兔：大耳 白，体重两公斤，本院动物中心提供。 本文于1990年7月23El收到。 本工作承刘传暄，于秀琴，周建光同志的帮助，特此致谢。 峪期 黄弘进等：霍乱弧菌脂多糖 0抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达 379 4·工具酶： (1）限制性内切酶：BamHl,EcoRI,HindlI1,Sall,Sacl为华美生物 工程公司产品。Hpal为PromegaBiotec产品。(2）牛肠碱性磷酸酶 (CIP):Boehri- nger公司产品。(3)RNaseA：中科院上海生化所产品。(4)T4-DNA连接酶：Promega Bic,Eec公司产品。 二（）方法 1.霍乱弧菌染色体DNA的制备 将霍乱弧菌接种于200m1LB培养基内，30cC振荡 培养至O.D之0.3-0.4,离心收集菌体，悬于4mITE(50mmol/LTris-ClpH7.4,1mmo1/ LEDTA)，加入 RNaseA53;Omg,500C水浴 1小时，用 TE(50:1pH7.4)调至终体积20 ml，加 2m1三氯乙酸 （pH7.4）中和，然后用等体积的酚 (pH7.4）抽提，收集水相，重 复3次；用氯仿抽提 1次，用 5mol/LNaCl调至终浓度为 O.lmol/L的酒精沉淀后，用玻 璃棒搅出，晾干，溶于适量的TE(pH8.0)0 2.克隆库的构建DI·用限制性内切酶 sad 完全酶切霍乱弧菌染色体 DNA，回 收1020kb左右的片段，载体质粒为 B.S(Ml3+),pUC18经 Sad酶切后，用牛肠磷 酸单醋酶脱磷，防止其自身环化。取上述两种DNA适量混合，加入 T4-DNA连接酶。 12℃反应 18小时。E.coliHB101感受态细胞的