生物化学--实验七邻甲苯胺法测定血糖.docVIP

实验七 邻甲苯胺法测定血糖 【目的要求】 1.掌握邻甲苯胺血糖测定法的基本原理及操作方法。 2.熟悉邻甲苯胺血糖测定法的影响因素及控制方法。 3.了解邻甲苯胺血糖测定法的临床意义及应用。 【实验原理】 血清样品中的葡萄糖在酸性环境中与邻甲苯胺共热时，葡萄糖脱水转化为5-羟甲基α-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺结合为蓝绿色的醛亚胺（Schiff硷）。血清中的蛋白质则溶解在冰醋酸和硼酸中不发生混浊。将标准葡萄糖溶液与样品按相同方法处理，在680nm波长处比色，即可测得样品中葡萄糖含量。邻甲苯胺法测得正常空腹血糖值为3.9～5.6mmol / L (70～100mg %)。 HC——CHC C—CHO HC——CH C C—CHO HOH2C O 羟甲基糠醛 CHOH——CHOH CHOH CHOH—CHO HOH2C 己醛糖 H H2O 酸中△ CH3 CH3 ＝N— HC———CH C C—CH HOH2C O 醛亚胺（兰色） CH3 H2N— 邻甲苯胺 【实验准备】 一、器材 1. 721型分光光度计、沸水浴。 2. 5×15cm试管、刻度吸量管。 二、试剂 1.邻甲苯胺试剂 称取硫脲(AR)级2.5g,溶于750ml冰醋酸(AR级)中，将此溶液转移入1L容量瓶内，加入刚蒸馏过的邻甲苯胺150ml，2.4％ 硼酸溶液100ml及冰醋酸至1000ml刻度，置棕色瓶中至少可用两个月。 2.葡萄糖标准储存液（10 mg / ml） 用0.25％苯甲酸溶液配制。 3.葡萄糖标准应用液（1mg / ml） 取贮存液10ml放入100ml容量瓶中，用0.25％苯甲酸溶液稀释至100ml。 【实验操作】 1.采得待测血样（抗凝）后立即离心以分离血浆（3,000转离心15分钟）。 2.取干燥试管3支，分别标出号码，按下表添加试剂。 邻甲苯胺法测血糖操作表 管 别 试剂(ml) 测定管 标准管 空白管 血清（浆） 0.20ml ── ── 葡萄糖标准液 ── 0.20ml ── 蒸馏水 ── ── 0.20ml 邻甲苯胺试剂 6.0ml 6.0ml 6.0ml 3.混匀各管内容物置沸水浴中加热15分钟后取出用流水冷却。 4.以空白管校正零点，读取各管680nm处吸光度值。 × × 葡萄糖标准液值 ×100/0.2 血糖mg%＝ 测定管吸光度 标准管吸光度 【注意事项】 1.本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反应。故测定值较Folin-吴宪法为低。 2.显色反应与水的含量有关，故应使标准管和测定管的含水量一致。 3.温度对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。 4.显色后颜色不稳定，室温每放置1分钟，颜色降低0.15％。 5.邻甲苯胺试剂中冰醋酸浓度很高，使用不当容易损坏比色仪器。 6.邻甲苯胺是致癌剂，测定过程中应小心使用。 【思考题】 1.试讨论血糖测定的临床意义及应用。 2.哪些因素影响邻甲苯胺法测定血糖的显色反应？操作过程中如何减少这些因素对测定结果的影响？