下丘脑视前内侧核(MPO)TRPV4对急性冷暴露过程中大鼠BAT产热的影响.pdfVIP

科大学实验动物中心提供。将动物随机分为6组：正常对照组(N)、单纯冷暴露 冷暴露组(R+C)。 (2)大鼠MPO插管和体温测量发射子植入 下丘脑MPO插管：将大鼠用10％水合氯醛(3ml／kg)腹腔麻醉，然后将其 头部固定于立体定位仪上，暴露前囟。参照大鼠脑图谱，向下丘脑MPO(B：0mm； L／R：1．5mm；V：8．3nun)与矢状面成lOo夹角，两侧分别插入一不锈钢管，并 留置与之相匹配的针芯，用牙托水加牙科水泥固定。 检测插管位置：实验结束后，在MPO中微量注射液体染料亚甲蓝lul。随后 用4％多聚甲醛经大鼠心脏灌流，取出经多聚甲醛固定的大脑。将其置于30％蔗 糖溶液中脱水后，制备冰冻切片，显微镜下观察插管位置。 体温遥测发射子植入：在麻醉状态下，于大鼠腹腔植入遥测系统发射子。术 后动物单笼饲养，恢复一周后进行实验。 2、体温测量 应用BW-200生理无线遥测系统测量大鼠体温。实验前一日早上8时开始记 录大鼠基础体温，每隔30分钟测量体温1次，共测量6小时，取其平均值记为基 础体温。实验均在早8时丌始，各组在相应处理后开始监测体温变化，每隔5分 钟自动记录体温一次，直到实验结束。 3、下丘脑MPO细胞内钙离子浓度([Ca2+】i)测定 采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。 4、下丘脑MPO中TRPV4表达测定 (1)Western blot检测下丘脑MPO中TRPV4表达。对照选用抗p肌动蛋白 表达量。 (2)免疫荧光检测下丘脑MPO中TRPV4表达，荧光显微镜下观察并摄片。 5、BAT组织中UCPlmRNA表达测定 2 胶电泳后，用凝胶成像分析系统进行基因表达水平分析。 6、大鼠BAT质量及BAT总蛋白含量测定 用Folin．酚法，以牛血清蛋白为标准，采用分光光度计测定BAT样品中的总 蛋白质的浓度。 7、BAT中线粒体蛋白含量检测 提取BAT中线粒体，线粒体蛋白质定量用Folin．酚法，以牛血清蛋白为标准， 采用分光光度计测定。 8、大鼠BAT中细胞色素C氧化酶(COX)活性检测 使用COX活性检测试剂盒(GENMED，USA)检测COX活性。 9、数据分析 所有实验数据均用均数士标准差(z士s)表示，各组均数间差异的比较应用t 检验，相关分析用相关性检验分析法。 结果 无明显变化；BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量、UCP．1mRNA表达 量、细胞色素C氧化酶活性均无明显变化；MPO中TRPV4表达增加，细胞内钙 离子浓度升高。单纯给予TRPV4特异性阻断剂RNl734组(R)，体温明显升高； BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量明显降低，UCP．1mRNA表达量、 细胞色素C氧化酶活性明显升高；MPO中TRPV4表达降低，细胞内钙离子浓度 降低。 与对照组(N)比较，单纯冷暴露组(C)的体温下降，且有统计学意义； BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少、UCP．1mRNA表达量增 加、细胞色素C氧化酶活性增加；MPO中TRPV4表达略增加，但细胞内钙离子 浓度降低。 3 露时体温明显下降；BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度低 于C组；MPO中TRPV4蛋白表达、细胞内钙离子浓度高于C组。预先给予 白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度高于C组；MPO中TRPV4蛋白表达、细胞 内钙离子浓度均低于C组。 结 论 制通道在细胞膜上的表达。 子浓度。 BAT产热活动。 关键词 MPO；TRPV4；急性冷暴露；BAT；4a．PDD；RNl734；UCP．1 4 TRPV4isamemberofthevanilloid oftransient subfamily receptorpotential(TRP) channelsandactasCa+ionchannel