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葡聚糖凝胶过滤分离蛋白质 内蒙古农业大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 制作人：王瑞刚 实验原理 实验材料与器材 实验步骤 实验原理 凝胶过滤层析利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，各物质在柱中存在两种运动，一是随洗脱液垂直向下移动，二是无定向的扩散运动。直径大于凝胶孔径的大分子，不能进人胶粒内部，便直接沿着胶粒间隙溶剂先流出，称为全排出)；小分子物质，直径小于凝胶孔径，能自由进出能容纳下它们的孔穴，绕道而行，结果在柱中的保留时间增长而最后流出;中等大小的分子，能进人部分胶粒内部，从而在柱中的保留时间较大分子长，但较小分子短，中间流出。于是，流过凝胶柱的混合物按其分子大小W被分离。 混合物中某一被分离成分在一定的凝胶层析柱内的洗脱，通常用分配系数(Kd)来表示。其定义为： Kd=（Ve一V0）/ Vi Ve，某一被分离物成分被洗脱时所用洗脱液的体积 Vo，凝胶颗粒间自由空间的总体积 Vi，胶颗粒内部孔穴的总容积 大分子物质，其Kd=0，小分子能全部进人胶粒内的Kd=1，中等大小分子，Kd在O～1之间。 凝胶过滤法的分辨率（ρ）是凝胶层析中的另一个主要特征常数。从数学角度上可以表示为： ρ=２（Ｖ２－Ｖ１）／（Ｗ１＋Ｗ２）　（≥１）　 Ｖ２、Ｖ１，是两种被分离物的洗脱体积 W１、W２，是两个物质的洗脱峰的宽度。两个相的物质要想完全分离，ρ≥１。 实验材料与器材 胰蛋白酶（分子量为23KD）和牛血清白蛋白（分子量68KD）混合物、层析柱50cm×l.lcm、核蛋检测仪、部分收集器、sephadex G一l50 实验步骤  1．凝胶的处理：取干燥的Sephadex G一l5O浸泡在洗脱液 （本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）中，充 分溶胀，注意不要过分搅拌，以防颗粒破 碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加 热至将近1OO℃，还可以排除凝胶内部的 汽泡。 2．装柱：将柱子及其附件清洗干净先将下口接好，加上缓 冲液，将出口处的汽泡排除，待柱内剩有2cm左 右液柱时，关紧流出口，将己溶胀好的凝胶的上 清液吸去，轻轻搅拌凝胶顺层析柱或玻璃棒一次 性倾倒入层析柱，待底部自然沉降有一定凝胶 后，打开流出口，直至凝胶沉积至所需高度。加 盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实 验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱 床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是 否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。 上样： ①用蒸馏水溶解胰蛋白酶含量为l5mg/ml，加样 体积为0.4cm高。 ②吸去柱床上的溶液，直至胶面刚露出为止。 ③将样品沿柱壁四周缓慢加入(别搅动胶面) ④打开下流出口，使样品进入胶床。 ⑤再如上法，加１－2次小体积的洗脱液冲洗内 壁，完成后，将洗脱剂与流入口相接进行洗脱。 4．洗脱：借助重力洗脱即可，洗脱时要控制流速为 4m1/3Omin。收集时用自动部分收集器收集，每 管4m1，洗脱物各组分收集根据核蛋仪及层析图谱 仪的数据与流速共同来决定（若无采集图谱时， 还需要在分光光度计上测定OD28Onm来定）。 5．保存：样品洗脱完毕，根据层析图谱和自动部分收集器 的数据将各组分合并，保存可以冷冻，也可浓 缩。 凝胶的回收：取下层析柱，将上