第十三章 核酸研究技术课件.ppt

利用附加表位标签研究蛋白-蛋白相互作用 一个特定蛋白与附加表位标签作为融合蛋白在细胞中表达 融合蛋白被附加表位标签抗体特异沉淀 与特定蛋白相互作用的其它蛋白一起被免疫沉淀下来 分析鉴定这些蛋白能揭示在细胞内特定蛋白的蛋白-蛋白相互作用 这些附加表位标签可以是 GFP， HA， Myc, Flag等 串联亲和纯化蛋白复合体 在细胞中表达串联标签融合蛋白 用IgG （结合Protein A) 亲和纯化柱子纯化融合蛋白 用特异蛋白酶切，除掉Protein A 用钙调蛋白亲和纯化柱子纯化融合蛋白 得到纯化的融合蛋白， 质谱分析 酵母双杂交分析蛋白X-蛋白Y相互作用 X和Y 分别与转录因子Gal4p的结合结构域和激活结构域融合表达。 如果X与Y互作，将形成完整的Gal4p，从而激活报告基因的表达。报告基因通常是酵母生长必须的基因或可催化产生有颜色产物的酶， 从而酵母可特定条件下存活和带有颜色。 双分子荧光互补（BiFC）分析蛋白-蛋白相互作用 BiFC分析技术，是一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术, 它巧妙地将荧光蛋白分子的N端 （YN）和C端（YC）片段分别与目标蛋白融合a和b融合表达。 如果a与b互作，将形成完整的荧光蛋白，发出荧光。 酵母双杂交分析蛋白X-蛋白Y相互作用 Left panel：Interaction of a ROP GTPase with an effector protein was detected in the plasma membrane. Right panel：Interaction of a mutant non-prenylated ROP with the same effector was detected in the cytoplasm and nuclei. 本章主要知识点 核酸电泳多为水平式琼脂糖凝胶电泳，在中性pH条件下，一般按核酸分子大小进行分离。 DNA序列测定常采用Sanger双脱氧法。 PCR是利用耐高温的DNA聚合酶，通过对目的DNA片段的变性、退火、引物延伸等过程的循环进行，来实现目的DNA的体外大量扩增。 本章主要知识点 重组DNA技术是将目的DNA片段整合到宿主基因中来实现体内大量扩增的方法。 将外源基因通过质粒转入具备完整蛋白质表达体系的宿主细胞内，可以实现目的基因所编码蛋白质的大量表达。 RNA干扰（RNAi）：内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA特异性降解，导致靶基因表达沉默的现象。 本章主要知识点 荧光蛋白能帮助确定特定蛋白在细胞中的定位 免疫荧光也用于特定蛋白在细胞中的定位 利用附加表位标签、酵母双杂交、双分子荧光互补分析可研究蛋白-蛋白相互作用 此方法由科学家 Jeremy Southern发明， 因而得名。 分、切、接、转、筛、表达 X-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶 “基因组(genome)”一词是1920年Winkles从GENes和chromosOMEs组成的。 （5）基因重组体的鉴定 重组质粒的快速鉴定 将经培养后平皿上的菌落单独挑到细菌裂解液中，于37℃下保温15分钟后离心后取上清进行1％琼脂糖电泳，观察电泳带，各种DNA形式的迁移率不同。 重组质粒的限制性内切酶解分析 挑选少许转化菌落，提取质粒，然后用限制性内切酶进行酶解，酶解液进行电泳，与标准DNA带比较大小，分析是否有外源DNA插入。 重组质粒的鉴定： 1 2 3 4 5 1， 2： 含插入片段的质粒 3，4：不含插入片段的质粒 5： 分子量标记 （6）重组基因的大量表达 对含目的基因的宿主细胞进行扩增（克隆），分离纯化目的基因。 7. 重组DNA技术的应用 外源蛋白的表达 转基因技术 疾病相关基因的分析 基因诊断 基因治疗 （1） 外源蛋白的表达 质粒载体pBR322称为克隆载体，常被用来插入外源DNA，用来大量复制DNA。 如果目的是为了由外源DNA生产蛋白质，需要一个表达载体。表达载体必须要通过细菌将基因转录和翻译成相应的蛋白质。 多克隆位点 表达载体除了含有复制起点、多克隆位点以及抗生素抗性基因外，还需拥有启动子；转录终止序列；被转录的mRNA要有一个核糖体结合位点。 典型的表达－克隆载体：目的DNA插入位置刚好位于启动子区的下游；重组质粒转化大肠杆菌，进行转录和翻译。 转录要通过细菌核糖体结合位点，然后进入插入片段，mRNA中的细菌核糖体结合位点的存在可确保通过宿主菌的核糖体将mRNA翻译成蛋白质。 大肠杆菌中表达目的蛋白 用GSH亲和层析纯化， GST融合