现代微生物学实验技术.pptxVIP

绿色糖单孢菌的发酵及胞外酶的提取 北京林业大学 生物科学与技术学院 2012-10-20 试验目的 了解发酵应用的广泛性 了解利用发酵罐进行高密度培养的技术 掌握发酵罐的使用原理和方法 掌握酶活测定方法 试验原理 绿色糖单孢菌（Saccharomonospora viridis）是一种耐热耐碱的放线菌，产胞外木素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶。 发酵：微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径转变成所需的产物的过程。 影响发酵的条件：培养基成分、温度、诱导时机及诱导剂、溶解氧、pH等。 实验材料 菌株：绿色糖单孢菌（Saccharomonospora viridis） 培养基 种子培养基：大豆蛋白胨1%、酵母粉0.2%、酶水解酪素0.2%、氯化钠0.6%、葡萄糖1% 发酵培养基：种子培养基中加入诱导物0.2% xylan pH 7.8~8.0 灭菌温度：115℃，30min 试验方法 步骤： 数据分析 生长曲线及产酶曲线 木聚糖酶的比活（包括木糖标准曲线、蛋白含量标准曲线等） 生长曲线及产酶曲线 生长曲线测定： 在发酵培养过程中，从接种后每6h取样（3ml），测定其在OD600条件下的吸光度值，至发酵结束。 以同条件下未接种培养液为空白对照，培养时间为横坐标，菌液的OD600吸光度值为纵坐标绘制绿色糖单孢菌在的生长曲线。 产酶曲线测定： 在发酵培养过程中，从接种后每6h取样（2ml），分别测定其木聚糖酶和纤维素酶的比活。 木聚糖酶活测定方法 制作木糖标准曲线。 ⑴用PH7的磷酸缓冲液分别配制浓度1mg/mL的木糖溶液。 ⑵取十支带有刻度的25mL试管，分别吸入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL木糖溶液。 ⑶加入磷酸缓冲液，使每支试管的溶液体积为1.5mL。 ⑷每支试管中加入1.0 mLDNS溶液，在沸水中反应5min,反应后迅速冷却至室温。 ⑸向每支试管中加入10 mL蒸馏水，在540nm处测定溶液的吸光值。 木聚糖酶活测定方法 酶活测定方法： 粗酶液稀释10倍作为待测酶液； 用pH7的磷酸缓冲液配制得到1%的木聚糖溶液作为木聚糖酶的底物，在试管中加入0.5mL底物，0.1mL酶液和0.9mL磷酸缓冲液，于60℃下水浴20min，加入1mLDNS试剂，在沸水中煮5min,冷却后加蒸馏水10mL混匀后，540nm处测定其吸光度。 蛋白含量测定方法 考马斯亮蓝G-250法蛋白质浓度 1 2 3 4 5 6 样品蛋白 ml （c=0.1mg/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250 ml 5 5 5 5 5 5 蛋白含量μg 0 20 40 60 80 100 3组分工 第一组：菌株S.v 发酵培养基：STS+xylan 第二组：菌株S.v-artp1 发酵培养基：STS+xylan 第三组：菌株S.v-artp2 发酵培养基：STS+xylan 4组分工 10.20 上午 固体平板挑去单菌落接种于STS液体培养基中活化培养； 准备好的活化液以1：200的比例接种于发酵培养基中45℃，120rpm发酵培养； 下午：16:00 取5ml发酵液，3ml用来测定吸光度，2ml编号存放于4℃ 22:00 取5ml发酵液，3ml用来测定吸光度，2ml编号存放于4℃ 每天 上午 10:00 下午 16:00 晚上 22:00 以上操作共7天，10.27日上午将7天保留的样品（21个）测木聚糖酶的比活。 谢谢！