蛋白质的理化性质与分离分析.ppt

离子交换层析原理 离子交换层析的洗脱过程示意 反相层析中的离子配对试剂的作用 （四）反相离子对色谱法的分离条件 固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相， 离子配对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 流动相pH　使试样组分与离子对试剂全部离子化 有机溶剂及其浓度 同一般HPLC 离子交换层析，利用物质在特定pH条件下的带电种类及带电电量的不同进行分离。柱料带有电荷的人工合成高分子材料，带负电的为阳离子交换剂，带正电荷的为阴离子交换剂。 图示为阳离子交换层析，每种蛋白质与柱电荷的亲和力受pH（决定分子的离子化程度）及溶液周围竞争性的其他离子浓度的影响。层析可以通过逐渐改变流动相pH和/或盐浓度以形成pH或盐梯度来完成。 离子交换层析分离蛋白质 分子排阻层析(size-exclusion chromatography)，也称凝胶过滤(gel filtration)，根据蛋白质分子的大小进行分离。柱料是具有特定孔径大小的交联聚合物。由于较大分子的蛋白质不能进入柱料的微孔内部，，流经柱的直接路径短，因而比较小分子蛋白质的移动速度快而先被洗脱出来；较小分子的蛋白质进入微孔内部，因相对较长的流经距离而移动得慢而后被洗脱。 亲和层析(affinity chromatography)，根据蛋白质分子的结合特性分离蛋白质。滞留在柱料上的蛋白质是能特异性与柱料表面交联的配体结合的蛋白质。非结合的蛋白质在平衡过程被洗掉，结合到柱上的目的蛋白质用含有游离配体的溶液洗脱下来。 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 利用高压泵，加快蛋白质分子沿柱流动的速度，提高层析效果，缩短层析时间，消除扩散影响，提高分辨率。 HPLC层析系统 泵的结构 实验室用层析柱 工业用层析柱 ? 0.5-5 cm ? 5-100 cm 填充物的多孔化可以减少层析压 灌注层析示意 附:Classification of Chromatography 通常一个特定蛋白质的分离纯化会用到几种不同手段的组合，每种方法的选择也是经验性的，在最终确定最有效的方法前需要进行多种方法及其组合的尝试。一般情况会出现以下不同方法的试验和最终组合。 有一蛋白质分子量14kDa, pI 10.2, 65℃不变性, 50%酒精不沉淀, 请设计分离纯化方案。 * * * * 双向电泳(Two-dimensional Electrophoresis, 2-DE) 先后结合等电聚焦和SDS电泳的技术被称为双向电泳，能使得复杂蛋白质的混合物得到好的分辨。较其他单独使用的电泳分析方法的灵敏度更高。双向电泳能分开不同pI但分子量相同或相近的蛋白质，也能分开相近pI但不同分子量的蛋白质。 第一向在圆筒形凝胶进行等电聚焦。然后将等电聚焦凝胶平放到平板SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，水平方向反映的是pI差距的电泳，垂直方向反映的是分子量差异的电泳。 E. coli’s Proteins O’Farrell的蛋白质双向电泳 银染结果 考马斯亮染色为蓝色 毛细管电泳 (Capillary Electrophoresis, CE) 毛细管电泳又叫高效毛细管电泳(HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行电泳分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988-1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。 high performance capillary electrophoresis apparatus “CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其仪器结构包括一个高压电源, 一根毛细管, 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 电压：0-30 kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19-10-21 mol/L） 高压电源 （1）0-30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源