流式细胞术原理及在中医药研究中应用简介.ppt

细胞周期分析——ModiFit 分析 细胞周期分析——ModiFit 分析 大鼠生精细胞分析——PI单染 细胞凋亡—PI加Annexin V双染 FITC-Annexin V PI 淋巴细胞亚群分析 CY5.5-CD3 FITC-CD4 PE-CD8 培养细胞表面粘附分子表达 培养细胞表面粘附分子表达 FCM样品来源 需要制备细胞悬液 血液、体液等液体样品 培养的细胞 活体组织样品 冰冻组织 固定的组织样品 直接应用 分离后使用 样品制备 细胞分离方法 直接离心沉淀 物理方法分离（超声波、筛网等） 酶消化 如果是固定的组织，先脱蜡，再用物理或化学方法分离 样品染色步骤 PBS洗细胞1~2次 加（荧光）单抗，暗处孵育15~30分钟 如果必需，加荧光二抗，暗处孵育15~30分钟 PBS洗细胞一次 过300目尼龙网 上机检测 PI单染测细胞凋亡步骤 制备细胞悬液 PBS洗细胞1次，1000rpm离心10min，去上清。 加PI染液（含PI 50mg/ml, Rnase 50ug/ml)，暗处孵育30分钟 过300目尼龙网 上机检测 淋巴细胞亚群分析实验步骤 采集血液样品 取三色标记抗体或三种单色标记混合抗体20μl至Eppendorf管，加血样50μl，混匀后避光保存20min。 加入1×红细胞溶解液450 μl，混匀避光保存10min，500g离心5min，去上清，加PBS 1ml洗1次后加PBS 0.5ml摇匀。 过300目尼龙网，上机检测。 谢谢！ * PMT Photomultiplier tuber, FCM的临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 FCM的科研应用 树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 FCM的应用——肿瘤学 细胞周期分析 细胞凋亡的分析 凋亡细胞的分析 凋亡相关蛋白的分析 肿瘤相关基因表达的研究 多药耐药基因的研究 细胞周期分析 细胞周期 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA分析 细胞数量 2N 4N DNA分析的临床意义 DNA分析诊断肿瘤 DNA非整倍体细胞峰 突出的四倍体细胞峰 SPF15% DNA倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。 增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT) 多发性骨髓瘤 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用 DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡分析 细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋亡的主要检查手段 形态学检测 Ladders实验 流式细胞术检测 与凋亡相关的病理过程 HIV 自身免疫性疾病 肿瘤 细胞凋亡分析 细胞凋亡的主要指标 细胞内酶改变：Caspase-3活化 细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI 细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT） 凋亡相关蛋白： Fas Bcl-2 细胞凋亡—PI分析 PI - Fluorescence Events 调亡细胞 正常G0/G1期细胞 细胞凋亡—Active Caspases-3 细胞凋亡—Caspases-3 细胞凋亡—Annexin V 细胞凋亡—Annexin V 细胞凋亡—BrdU FCM的应用——免疫学 淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 HIV的诊断与研究 淋巴细胞 CD4/CD8分析 CD4绝对计数 T细胞活化 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 FCM的免疫学应用 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究 HLA-B27检测 淋巴细胞亚群分析 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数 临床意义 了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临