细胞培养技术讲义.ppt

?四、细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品：  PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基  3. 步骤： 3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。 2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。 3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。4） 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量的新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 1） 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 2） 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。  五 细胞冷冻保存 1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO， 冷冻方法：  传统方法: 4℃30分钟---20℃60分钟---80℃ 16-18小时(或隔夜)-- 液氮槽蒸汽相中长期储存。  2. 材料用品 1） 生长良好的培养细胞  2） 新鲜培养基  3） DMSO (Sigma D-2650)  4） 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)   3. 操作步骤： 1）冷冻前一日前更换培养基，观察细胞生长。 2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混 合均匀，分装于已标示完全冷冻保存管中，1 ml/小瓶，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 5） 冷冻保存方法: 冷冻管置于4℃30分钟→-60℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽蒸汽相长期储存。  细胞的冻存: 1) 选取对数增长期细胞，在收集细胞前24小时换液一次。 2) 按常规方法把培养细胞消化下来,制备成细胞悬液,计数,使总数达5×106/mL左右,离心（1000g,5min）,去上清。 3) 用等量冻存液（含20％小牛血清，10％DMSO的DMEM培养液），用吸管轻轻吹打成细胞悬液。 4) 分装入冻存管中，拧紧，用封口膜封严；分别于冻存管管壁和管盖编号。 5) 将冻存管放入冻存袋中，并在冻存记录本上注明位置，细胞名称，冻存日期； 6) 将冻存袋装入液氮罐中，以1℃/min的速度，在30?40min之内下降到液氮表面，再经30min后，投入液氮中。或者先放在?20℃冰箱放置2h，然后转入?80℃冰箱，可以?80℃冰箱一直冻存或者1?14天后转入液氮冻存。 谢谢 细胞培养技术 细胞培养技术 第一节 细胞培养基本知识 第二节 细胞培养的基本技术 第一节 细胞培养基本知识 一、前言 二、培养细胞的特性 三、培养细胞的生长过程 四、培养细胞生长的条件 一. 前言 1. 细胞培养概念 2. 细胞培养的主要优点 3. 细胞培养的研究方面 4. 细胞培养的应用领域 1. 细胞培养(cell culture)概念 从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术。 体内、外细胞的差异 体内细胞： 机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能 体外细胞： 失去机体神经体液调节和 其他类型细胞影响 细胞的许多外来信号被切断 特定分化基因表达减弱或停止 而进化中保守的增殖活动维持 （由特殊到一般） 与体内细胞结构和功能的差异 特征：失去原有形态，分化特性减弱 形态和功能趋于单一 一定代数后衰老死亡， 或发生转化， 获不死性而成为能无限传代 2. 细胞培养的主要优点 研究对象是活的细胞 研究的条件可以人为地控制 研究的样本，可以达到比较均一性 研究的内容便于观察、检测和记录 研究的范围比较广泛，多种学科均可利用细胞培养进行研究 研究的费用相对较经济 3. 细胞培养的研究方面 1）细胞内的活动：如能量代谢、DNA转录、调亡以及蛋白质的合成 2）细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物分泌等 3）细胞与细胞之间的相互作用：如形态发生、粘着作用、接触抑制、密度抑制等 4）细胞内的流动