第三节 目的基因的获得.pptVIP

第三节 目的基因的获得 PCR的反应过程 变性：使DNA双链解离变为单链。一般94℃～95℃，1min足以使模板变性 若低于94℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 PCR的反应过程 退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之间。 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度的计算公式 Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值－（5～10℃）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性； 复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。 PCR的反应过程 延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 PCR的反应过程演示 设计引物 引