(NGS)发现的变异进行Sanger测序验证.PDFVIP

利用创新生物信息学工具对基于二代测序技术 (NGS)发现的变异进行Sanger测序验证 摘要 二代测序(NGS)分析已经彻底改变了我们对于生物过程的理解。 的数据精度高且容易解读因此被认为是DNA序列分析的金标准。 在许多基础科学或应用科学研究中，通过比较不同群体研究对象 因此CE是用来验证在NGS平台上读出的变异的理想系统。为了 的原始DNA序列而获得了很多的进展。在这些研究中，研究人员 简化验证流程我们开发了一种基于网络的引物设计工具，适用于 试图找出群体间核酸序列的变异在疾病易感性、疾病进展或表型 进行PCR和Sanger测序，它基于以一种易于搜索的方式提供了 变异中发挥的作用。 针对于人类基因组上几乎所有外显子的预设计PCR引物对。使用 这些引物，研究者可以直接对由NGS发现的目标变异进行PCR 因此准确识别序列变异将有助于确保实验结果的成功。但是，由 扩增及Sanger测序。由此获得的Sanger测序结果数据(.ab1 files) 于NGS技术中使用的文库制备方法和试剂易产生低水平但可检测 可以使用一种新的被称为NGC(二代验证) 的软件对其进行分析并 的测序误差，因而会造成对实验结果的混乱或错误的解读。 将其与NGS vcf 变异文件进行比对。该软件直接将NGS发现的变 异与Sanger测序发现的变异进行比对，可视化检视并生成一个 因此，许多实验室使用正交方法，如利用Sanger的测序方法来验 经过验证的匹配报告，以及一个用于下游的生物信息学处理的 证NGS找到的变异：使用荧光双脱氧核苷酸终止聚合酶，然后使 含有基因组坐标的联合vcf文件。综上所述，Primer Designer和 用毛细管电泳基因分析仪(CE)采集序列信息。这是一种可靠且经 NGC分析工具实现了一个使用传统Sanger测序验证NGS变异的 济的方法，它的试剂和分析工具易于使用和理解-而且由于它 无缝工作流程。 NGS验证工作流程：4个快速简单的步骤 (任何)NGS平台：从 Primer Designer 选择/订购适用于Sanger 二代验证(NGC)软件使用 vcf文件选择变异 工具选择/ 订购适用于 测序的PCR引物 人类基因组比对NGS和 Sanger测序的PCR引物 Sanger测序数据 尽管二代测序(NGS) 实现了更高通量和更低成本的大型测序项 • 当变异出现在难测序基因组区域或变异由于二级结构、高度重 目，但使用毛细管电泳(CE) 的Sanger测序仍然是 “金标准”， 复序列或其它因素而代表性偏低时。 准确率达到99 .99%。它无与伦比的精确性在测序工作流程中起 • NGS靶向测序所使用的杂交或捕获方法也会影响一些序列在最 着重要作用-尽管NGS 已经被实验室所采用。但为了帮助确保 终文库中的代表性。 NGS测序结果的精确性和可靠性，Sanger测序仍被推荐用于NGS • 当需要基于准确的测序结果做出可行的决定时。 结果的验证： 第1步：找出并选择需要进行Sanger测序 第3步：一个快速流畅的PCR和Sanger测序工作流程 验证的NGS变异 第3步a ：使用BigDye Direct Cycle测序试剂盒构建靶标验证PCR 技术找到的目标变异可通过直接勾选并导入 • 5 μl PCR试剂(包含在试剂盒内) 到Primer Designer工具中。这使得订购CE测 • 3 μl dH20 序验证所需的引物更加容易。 • 1 μl Primer Designer工具给出的带有M13尾的引物对(每个1 μM) 如果使用Ion Torrent 以外的NGS平台，则 •