16SrRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA-中国农业科学.PDFVIP

中国农业科学 2017,50(5):932-941 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.05.016 16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组 DNA提取方法及菌群结构 1 1 1 1 2 2 杨琦玥 ，黄勇 ，陈亚冰 ，刘洛川 ，李键 ，兰道亮 1 2 （西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041 ； 西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041 ） 摘要：【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】 采用物理法（珠磨法、反复冻融法）、化学法（CTAB、SDS）及酶解法(溶菌酶、蛋白酶 K)三者与瘤胃细菌特点相 结合的方法，组合生成 9 种不同方法，即方法 1（CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法）、方法 2（CTAB+ SDS+Lysozyme+反复冻融法）、方法3（CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法）、方法4（CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法）、 方法 5（CTAB+Lysozyme+反复冻融法）、方法 6（CTAB+Lysozyme+珠磨法）、方法 7（SDS+Lysozyme+无特殊物理处 理法）、方法8（SDS+Lysozyme+反复冻融法）、方法9（SDS+Lysozyme+珠磨法），同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit（方法 10）为对照，以这 10 种方法来提取瘤胃微生物基因组 DNA，并通过 DNA 浓度、纯度、DNA 电泳图等基 本性质及 16S rRNA 高通量测序结果对其进行分析比较，同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结 果】不同 DNA 提取方法效率比对结果显示，同样的化学及生物酶裂解条件下，结合珠磨法及反复冻融法能够显著 地增强细胞裂解效率，提高 DNA 产量。其中方法 3 及方法 6 提取的 DNA 具有较高的浓度及纯度，方法 7—10 缺乏 CTAB阳离子去污剂，提取的DNA量显著低于其他方法 （ P0.05），除方法2 和8所提取的样品经多次试验 ，PCR 产 物目的条带太弱或未检测到外，其余8种方法提取的样品PCR 产物目的条带大小正确，浓度合适，符合高通量测 序的要求。16S rRNA高通量测序共生成了191 349条原始数据，质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分 析表明，数据量合理并达到饱和，能够完整反映样品的菌群种类。OTU 聚类数据统计、分类学和多样性指数分析 显示方法6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法6裂解革兰氏阳性 菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上，方法 6（CTAB-Lysozyme-珠磨）提取的 DNA 产量、样品多样性指数 及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括 21 门、35 纲、75 科、 112 属，丰度较高的菌群依次是拟杆菌 Bacteroidtes (64%)、厚壁菌 Firmicutes （20%）、螺旋体 Spirochaetae （2.3%）和变形菌Proteobacteri （1.8%），纤维杆菌Fibrobacter (1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存 在着一定的差异，这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用 16S rRNA 高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基 因组DNA理想提取方法，即方法6（CTAB-Lysozyme-珠磨），并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构，为研究牦牛瘤 胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。 关键词：牦牛；瘤胃微生物；DNA；提取方法；菌群结构 Scre