4目的基因的获取.pptVIP

复 习 题 1、-----热稳定性较好，可用来进行特定核苷酸序列的体外扩增； 2、-----可以在体外以mRNA为模板合成cDNA； 3、为避免载体自连，可以用------将DNA的5’磷酸基团去除。 4、----可以去除DNA片段中突出的单链尾巴。 5、寄主控制的限制与修饰现象涉及到的两种酶是-----和-------。 6、质粒的复制类型可分为——和——两种。 7、质粒的三种构型在琼脂糖凝胶电泳中速度最快的是——。 8、pUC18/19是——载体。 9、pUC118、119是——载体。 10、------年被公认为基因工程元年。 第一节 化学合成目的基因 要求： 已知目的基因的核苷酸序列； 较短的DNA片段。 应用范围： 1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头 4）较小的基因 固相亚磷酸三酯法 一、基本原理 二、支持物 可控微孔玻璃珠（CPG） 三、单体 3’位 二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的羟基用甲基或β-氰乙基保护 5’位 二甲氧基三苯甲基 （DMT） 四、反应步骤 第一步----核苷酸单体1的去封闭（Deblocking） 去除CPG所连核苷上的DMT，以暴露5’羟基 第二步----核苷酸单体2的活化（Activation） 形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体 第三步----连接（Coupling） 亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸缩合 第四步----盖帽（Capping） 封闭未反应的核苷酸单体1? 第五步----氧化（Oxidation） 三价磷氧化为五价的磷 多次循环直到合成所需的长度，用浓氨水将DNA从固相上洗脱下来，真空抽干，样品溶于适量水中进行纯化分析。 五、基因的组装 目前合成能力200b以内，若要合成更长的基因，则需要先合成短的序列，然后再拼接到一起啊，称为基因的组装。 二、 特点： 1.反复循环便于获得大量的基因拷贝； 2.多用于基因检测，如用于基因重组表达，须进行DNA序列分析。 三、逆转录PCR（RT-PCR) mRNA cDNA PCR 1、已知目的基因序列的RT-PCR 2、从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCR mRNA 5‘ AAAAAA3’ RT-GSP 逆转录 5’ AAAAAA3’ RT-GSP 变性、退火 5‘ AAAAAA3’ 3’ 5’ GSP 3’ 5’ 5’ 3’ 已知目的基因编码的蛋白N端部分氨基酸序列信息，可以以此设计特异引物，从总RNA中获得目的基因。 N端 C端 氨基酸序列：Val Phe Asn Ala Trp Lys Asp His 核苷酸序列:GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA(T/C) 引物1 引物2 简并引物1：GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA 共16种 简并引物2：GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA 共16种 反义引物：oligo（dT）12-18 mRNA 5’ AAAAAA3’