荧光定量PCR基础原理.PPTVIP

退火：产生荧光信号 结合SYBR Green I SYBR Green I 染料仅在与双链 DNA（dsDNA）结合时发射荧光，所发射的光波是蓝色光。SYBR Green I 不会与单链 DNA 结合，因此变性时荧光强度最低。dsDNA形成单链（图 A）合成双链（图 B）时，SYBR Green I 结合于dsDNA上，结合的 SYBR Green I（绿色光）的荧光信号强度增强。延伸末期（图 C）时，所有 DNA 均是双链，结合状态的SYBR Green I 含量达最大，该 PCR 周期中荧光信号也达最大。因此，通常是在延伸期结束时进行 SYBR Green I 荧光信号测定。 ○PCR扩增的理论模式 ○Real time PCR理论基础 PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。 由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。 因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。 通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，因此被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术。 PCR扩增的理论模式 PCR中，随着扩增周期的增加，模板以指数方式进行扩增。 PCR 理论方程：N = N0 × (1+E)n N: 扩增子数量 N0: 起始模板数量 E：扩增效率 n: 循环数 此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。 PCR分期——“S”形曲线 对 PCR 扩增过程的详细分析表明，PCR 扩增曲线可被分为三个典型时期： 早期背景扩增期、中期指数扩增期（或对数线形扩增期），以及晚期的平台期 理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线； 因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。 两种定量方法 两种定量方法 终点定量 起点定量 无规律 对数期分析：平行性好 终点产物数量：误差大 拐点产物数量：重现性好，误差小 影响因素多 扩增效率恒定，标准曲线呈线性 起始DNA量，更具意义 重现性好，误差小 扩增效率恒定，标准曲线呈线性 普通PCR技术的检测模式 普通PCR仪器扩增，约2.5小时 琼脂糖凝胶电泳，约1小时 EB染色，约20分钟 紫外成像 阴性 阳性 样品检测结果 无法定量 实时荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR仪器扩增，约2小时 检测过程有实时监测数据 光滑的S型指数曲线，阳性 无S型指数曲线，阴性 实时荧光定量PCR的检测模式 需绝对定量时 四个已知浓度的标准品，得到标准曲线 系统即可自动计算出未知样品的浓度 阴性结果曲线图示 阳性结果曲线图示 实时荧光定量PCR基本原理 在常规PCR反应的基础上，加入荧光染料或荧光标记的探针，随着PCR反应的进行，PCR产物不段累积，荧光信号强度等比增强。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而对起始模板定量及定性的分析。 荧光扩增曲线分三阶段 荧光背景信号，荧光信号指数扩增阶段，平台期 荧光背景信号阶段：该时期扩增的荧光信号被背景信号所掩盖，扩增产物量无法判断。 平台期：扩增产物不再呈指数增加，PCR终产物量与起始模板量无线性关系，无法计算起始DNA拷贝数。 荧光信号指数扩增阶段：该时期，PCR产物量的对数值与起始模板量呈线性关系，因此选择这一阶段进行定量分析。引入两个概念：荧光阈值和Ct值。 实时定量PCR的两个重要概念 （1）荧光域值（?threshold）：荧光扩增曲线上人为设定一个值，以PCR反应的前15?个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10?倍。 阈值 = 基线信号的标准偏差 x 10 实时定量PCR的两个重要概念 (2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循