微藻原生质体的分离.ppt

【实验目的】 1、学习总RNA分离的原理 2、掌握Trizol法总RNA提取的方法 3、了解各种的不同总RNA提取方法 【实验原理】 TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用DNase I来处理抽提的总RNA。 TRIZOL试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种RNA。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带（mRNA和hnRNA成分），两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。 【实验器具】 水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、Tip头、高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、微量移液器、分光光度计等。 【试 剂】 TRIzol、DEPC(焦碳酸二乙酯)、氯仿、异丙醇、无水乙醇、75％乙醇、TE缓冲液、TBE 电泳缓冲液（5×）、EB、上样缓冲液、琼脂糖等 【操作步骤】 1、组织匀浆化：用glass-Teflon?或强力匀浆器(Polytron, 或 Tekmars TISSUMIZER? 或equivalent)搅匀组织样品，每50—100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。（备选方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2～8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上层的超浮游物含有RNA。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤。） 2、分离阶段：将匀浆样品在15～30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力剧烈摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2～3分钟。在2～8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的60%。 3、RNA的沉淀：将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 ml TRIZOL对应0.5 ml异丙醇的加入量。将混合的样品在15～30°C条件下孵育10分钟，并在2～8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 4、RNA的洗脱：移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2～8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。 5、RNA的再溶解：在操作的最后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5～10分钟），不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。用无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，可在55～60°C下孵育10分钟，RNA还能用100%去离子甲酰胺溶解，–70°C保存。 6、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA ⑴配制1.2%变性琼脂糖凝胶(40 mL) 称取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL