土壤污染农药降解菌分离筛选、鉴定及基因克隆(李同祥措施,月日修订).docVIP

PAGE / NUMPAGES 土壤污染农药降解菌分离筛选、鉴定及基因克隆(李同祥方案 一、菌株的驯化筛选 取50 g污泥，置于装有100 mL培养基A的500 mL三角瓶中，加入100 mg/ L乐果(或DDZ，即所要分解的测试农药，30oC，100r/min,振荡培养14 d。 取上层浊液10mL，置于含有40mL培养基A的250 mL三角瓶中，加入300 mg/ L乐果(以乐果为例，别的农药操作相同，30oC，100r/min,振荡培养14 d。 再取上层浊液10mL，同法培养3次，乐果逐级分别提高到500 mg/ L、800 mg/ L、1200 mg/ L。 分别取1mL菌液于5个灭菌的平皿中，加入15mL(含300mg/ L 乐果，以乐果为例，别的农药操作相同冷却至45℃左右的培养基B，混匀，30oC， 培养3 d。 挑出单菌落在同样的培养基上纯化3次，保存。 各种农药平板培养基B+农药）降解水解圈实验初步确定）： 用“培养基B+农药”平板，对现有所有农药不同浓度下进行农药降解实验，能降解、不能降解的即有水解圈或无水解圈）的全部照相。 具体操作：纯化的单菌落用灭菌牙签平头端）挑去，点印到“培养基B+农药300mg/ L）”平板上，同时点印后的牙签放入事先准备好的LB液体培养基中1.5ml的PE管，或96孔培养版），培养至菌液饱和，备用(做下面的各种实验。取出一部分，按菌液的量，加20%的甘油即1ml菌液加0.2ml的甘油），-20℃保存。 表1 降解水解圈记录表 农药 培养基 培养基B+农药200mg/ L） 培养基B+农药300mg/ L） 2,4-D 敌敌畏 氧乐果 甲胺磷 草甘膦 氯氰菊酯 百草枯 对硫磷 溴氰菊酯 注：有水解圈的记为“+”，即可表示对该农药具有降解作用。无水解圈的记为“-”，即可表示对该农药不具有降解作用。 参考下图例图）：敌敌畏300毫克每升）的水解圈图 敌敌畏300毫克每升）JPG 制备菌悬液M：第三次挑出单菌落，接种于装有50 mL培养基C的250 mL三角瓶中，乐果浓度为300 mg/ L乐，30oC，100r/min,振荡培养1 d。4 000 rmiri’离心15 min，收集菌体。用培养基A溶解菌体沉淀，至菌体浓度为1 x 1010 mL-1(D600，此记为菌悬液M,备用。 菌种的保存：常用待测的菌种置于斜面培养基4℃保藏。长期保存需加20%甘油，-20℃保藏。 各种培养基： 培养基A(g.L-1: NH4NO3 0.5,Na2HPO4 1.19,KH2PO4 0.45,MgSO4 0.5. 去离子水1000ml.pH6.8. 培养基B(g.L-1: 在培养基A中加20g琼脂。 培养基C(g.L-1: 在培养基A中加500mg.L-1 葡萄糖。110℃灭菌20min。 富集培养基： 即LB液体培养基，胰蛋白胨 10g ，酵母提取物 5g ，NaCl 10g ，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L的NaOH调pH至7.0。 分离纯化培养基： 按基础培养基配方添加2.0%的琼脂粉，121℃下高压灭菌20min后，再添加农药作为碳源，制成平板。 LB固体培养基： 胰蛋白胨 10g ，酵母提取物 5g ，NaCl 10g ，琼脂粉15g，用5MNaOH调节该培养基的pH，使其达到7.2～7.5 葡萄糖发酵培养基： 牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 3g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O 2g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液，12mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.4。葡萄糖发酵管按以上成分配好后，按照0.5%的比例加入葡萄糖，分装于试管内，在每个试管中放置一个倒置的杜氏小管，121℃高压灭菌15min。 葡萄糖蛋白胨水培养基： 蛋白胨 7g，葡萄糖 5g，K2HPO4 5g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0～7.2，过滤，分装于试管，每管10mL，121℃灭菌15min。 蛋白胨水培养基： 蛋白胨 10g，NaCl 5g，蒸馏水 1000mL，pH 7.6，121℃灭菌20min。 淀粉培养基： 蛋白胨 10g，NaCl 5g，牛肉膏 5g，可溶性淀粉 2g，琼脂 15～20g，蒸馏水 1000mL，121℃灭菌20min。 石蕊牛奶培养基： 脱脂牛奶1000mL 石蕊溶液适量 制法：新鲜牛奶，除去乳脂；每100mL 脱脂牛奶加入4mL浓度为25g/L的石蕊溶液，使之成淡紫色；分装于试管中，可加适量液体石蜡；0.075MPa高压灭菌20分钟。 牛肉膏、蛋白胨琼脂培养基： 牛肉膏 0.3g、蛋白胨 1g、氯化钠 0.5g、琼脂 2g、自来水 100mL、