肉桂地链霉菌的发酵工艺优化.ppt

调控基因MonＨ（正调控基因）出现双交换的个体，待提基因组验证（？）。 在斜面培养基上，MonBⅡ与调控基因MonRⅠ、MonRⅡ均出现恢复到野生型的个体，继续采用液体液体培养基对其进行传代。 ST021全基因敲除 同样采用λ-Red重组系统进行全基因敲除，在ST021的阅读框外分别选取未知功能域处长度为3211bp、3196bp作为上、下游同源臂。 将Apr片段置换到上、下游同源臂之间，待酶切验证。 将林春燕构建好的带有部分埃博霉素基因簇的游离型质粒Cos002、整合型质粒Cos004进行结合转移转入到ST021。目前Cos002长出转化子，待验证。 将ST021原始菌株，进行单交换菌株 RⅠ分别涂在Kan浓度为100ug/ml 、120ug/ml、150ug/ml、180ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的斜面培养基上,分别看其所对应的抗性浓度。 继续对 RⅠ、 RⅡ、 H进行液体传代，每两天传代一次，然后吸取5ml菌丝体，用无菌水洗3次，涂在Apr的斜面培养基上。7天后在Apr板子上挑单菌落继续涂在含Apr的培养基上。 全基因敲除 将长出来验证过的转化子进行松弛培养，在固体培养基传代第一代，液体传达第二代。其余的转化子在Apr和Nali的高氏培养基上验证。 * * * * 肉桂地链霉菌的发酵工艺优化 选取高产菌株 作为底盘细 胞 底盘细胞 培养 形成单菌落 发酵 接合转移 构建转化体系 ST021菌株 对底盘细胞的目标产物进行验证 ST021发酵工艺的优化 种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1% 发酵培养基：葡萄糖4.5%，豆粕粉4%，硫酸钠0.22%，硝酸钠0.22%，氯化锰0.033%，硫酸铝0.007%，硫酸亚铁0.01%，抗坏血酸0.00019%，硫酸氢二钾0.00075%，碳酸钙0.25%， PH 6.7-6.8 第一批发酵第六天测得ST021的效价为：0.32g/L 第二批发酵第七天测得ST021的效价为：2.43g/L 存在问题 1.发酵过程中PH过高 培养1天后的种子液PH：8.05左右 第一批培养6天后的发酵液PH：8.64 第二批培养7天后的发酵液PH：7.25 计划： 1.继续优化ST021的发酵工艺，使其能够达到理想的效价。 2.继续做ST021的结合转移，构建其转化体系。 3.设计并敲除ST021聚酮合成基因，为埃霉素基因的导入做准备。 1.ST021抗性筛选 将ST021分别划线于含有Apr、Kan、Chl、tsr菌素的高氏培养中，观察知ST021对Apr有抗性，部分对Kan有抗性。 3.ST021转化体系的建立 1.与游离型质粒的结合转移 对ST021与W菌进行结合转移，将不同形态的菌落涂到含Apr和Nali的高氏培养基上，验证，然能生长。 2 整合型质粒的结合转移 将ST021与整合型质粒PIB进行结合转移，长出转化子，涂到含有Apr和Nali的高氏培养基上，仍能生长，待提基因组，验证整合到基因组的哪个位点上。 ST021单菌落发酵 单菌落 发酵液PH 效价 ST021-N1 8.88 0.653g/L ST021-N2 8.44 0.509g/L ST021-N3 8.82 0.833g/L ST021-N4 7.32 8.676g/L ST021-N5 8.71 1.052g/L ST021-N6 8.84 10.01g/L 不同浓度豆油发酵 豆油浓度 发酵液PH 效价 2% 8.90 0.635g/L