PCR技术详细步骤.docx

PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定 RNA抽提一，准备工作1， 实验器具与材料：（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul（2） 吸头：1ml、200ul、20ul（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4） EP管1.5ml、100ul（5） 玻璃研磨器（6） 容量瓶：1000ml（7） 盐水瓶：100ml（8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2， 实验器具的处理与准备（1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。（3） 金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3， 试剂配制和准备：（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。（2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。（3） 异丙醇：放入棕色瓶（4） 氯仿：放入棕色瓶（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三，抽提步骤1． 匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2． 分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，漩涡震荡15秒，使其充分混匀，冰上静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3． RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。34． RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5． RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。TRIzol法抽提总RNA细胞1×107组织100mg↓加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）↓颠倒混匀15S，室温5分钟↓4℃，离心12000rmp，15分钟↓转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中↓加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀后-20℃中1小时↓4℃，离心12000rmp，10分钟↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml↓4℃离心7500rmp，5分钟↓弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）↓溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）（可在55-60℃水中，10分钟助溶）↓立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录4逆转录（RT）一，准备工作1， 实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP管1.5ml、100ul（4）水浴箱2，实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸