实验8 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质.pptVIP

氨基黑10B染色洗脱法参考范围 氨基黑10B染色直接扫描法参考范围 * * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） Guangdong Medical College * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验8 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质 广东医学院检验学院　刘新光 实验 8 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质 实验目的 掌握：醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的基本原理。 熟悉：基本操作过程和临床意义。 了解：方法学评价。 实验原理 因各种蛋白质pI不同，在同一pH下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子量大小与分子形状也不相同，因此在同一电场中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快；反之则较慢。 由于染色时染料与蛋白的结合量与分离区带中的蛋白量成正比，因此将蛋白染色区带剪下，经洗脱、比色或经透明处理后直接用光密度计扫描，即可计算出各区带蛋白的相对百分数。 试剂与器材 1．巴比妥缓冲液 2．染色液-漂洗液-透明液-洗脱液 （1）丽春红S染色液—3%（V/V）醋酸溶液— 0.1mol/L NaOH溶液 （2）氨基黑10B染色液—甲醇— 0.4mol/L NaOH溶液 3．电泳仪 电压0～600V，电流0～300mA 4．电泳槽 5．721分光光度计 6．醋酸纤维素薄膜 操作步骤 准备电泳槽和CAM 透明 扫描定量 波长520nm 染色 漂洗 0.1mol/L NaOH 0.4mol/L NaOH 2 min～3min 点样 8V/cm～15V/cm 0.3mA/cm～0.5mA/cm 丽春红或氨基黑 染色5 min～10min 电泳 新鲜血清3μl～5μl 计算 AX表示各区带蛋白质（Alb，α1、α2、β和γ-球蛋白）的吸光值 AT表示各区带蛋白质的吸光值总和 区带蛋白绝对浓度（g/L）＝ 血清总蛋白（g/L）×各区带蛋白百分浓度（%） 参考范围 每个实验室应根据不同的实验条件和检测对象设定参考范围。 正常血清蛋白电泳一般可分为5条区带，即Alb、α1、α2、β和γ-球蛋白。 临床意义 1．M蛋白血症 在β、γ-球蛋白或γ-球蛋白区带后 出现M蛋白带。 2．蛋白缺乏症 α1-或γ-球蛋白部位蛋白降低。 3．肾病 Alb降低，α2和β-球蛋白升高。 4．急慢性炎症 α1、α2和β三种球蛋白均增高。 5．慢性肝炎和肝硬化 出现 “β-γ桥”。 注意事项 1．标本应新鲜，不得溶血。 2．电泳槽两侧的缓冲液液面要保证一定高度并保持同一水平。 3．在电泳前，须使CAM浸泡透彻。 4．电泳后区带应无拖尾，各区带明显分开。 5．染料应对蛋白质的各组分亲和力相同，水溶性好、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳定且易洗脱比色。 评价 优点 CAM电泳灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷。CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既可比色定量，又可透明后进行光密度扫描。 缺点 有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增大。当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发，造成蛋白质分子变性破坏。