实验二土壤中微生物的分离纯化及观察.pptVIP

实验二 微生物的分离纯化及观察 实验内容 培养基的制备及灭菌 微生物的分离纯化及菌落观察 平板菌落计数法 微生物的接种方法 微生物的培养方法 细菌的染色及形态结构观察 酵母菌的形态观察及大小、数量测定 放线菌、霉菌的形态观察 一、培养基的制备及灭菌 目的要求 明确培养基的配制原理； 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤； 掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 按培养基的用途分 基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基 培养基的配制方法和步骤 称量：按照配方正确称取各种原料置于搪瓷杯中； 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，补足水分； 调pH值：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH（试纸法或酸度计法）； 过滤 分装 加塞 包扎 灭菌 搁置斜面 无菌检查 无菌水的制备 100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水90mL; 试管中装9mL自来水; 塞上棉塞，包扎、灭菌备用。 灭 菌 干热灭菌 火焰灼烧法 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌 火焰灼烧法 直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。 干热灭菌法 设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时 注意事项： 温度不可超过180℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。 灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。 灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 电烘箱内温度＜70℃时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 加压蒸汽灭菌法 设备：高压蒸汽灭菌锅 0.1MPa，121℃，20min灭菌 注意事项： 切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。 压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。 思考题 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？ 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题？为什么？ 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。 在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 二、微生物的分离纯化及菌落观察 目的要求 实验器材 操作步骤 （一）目的要求 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术； 观察并识别微生物的菌落特征（群体形态）。 （二）实验器材 样品：新鲜土壤、枯草芽孢杆菌、酵母菌、链霉菌、黄曲霉 培养基 淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基）、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基。 无菌水 10%酚，装有9mL无菌水的试管，装有90mL无菌水并带有玻璃株的三角烧瓶。 仪器及其他用具 无菌玻璃涂布棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、30μg/mL链霉素、显微镜等。 （三）操作步骤 倒平板 在高氏一号培养基中加10%的酚，在马铃薯蔗糖培养基中加入链霉素(30?g/mL)，这样可减少所不需的杂菌。 制备土壤稀释液 平板分离法 平板涂布法 平板划线分离法 培养 高氏一号培养基平板和马铃薯蔗糖培养基平板：28℃培养3~5d 牛肉膏蛋白胨培养基平板： 37℃培养2~3d 菌落观察 观察并描述实验室提供的细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的菌落特征； 根据土壤分离后的菌落特征，判断微生物类群； 挑取不同微生物类群的单菌落进一步分离纯化。 （四）实验结果 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因重做。 在三种不同的平板上你分离得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。 （五）思考题 如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明的实验方案。 三、平板菌落计数法 目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法。 基本原理 通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。 实验器材 土壤稀释液的三种不同培养基的培养平板 菌种：大肠杆菌菌悬液 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有9mL无菌水的试管等。 两种计数方法 倾注法 涂布法 计数：选择每个平板上长有30~300个菌落数的稀释度计算样品含菌量。 实验结果 根据土壤稀释液在三种不同培养基平