第四章分子生物学研究技术.ppt

4.物理学方法 （1）电泳法筛选 转化E.coli 电泳 A B A B 4.物理学方法 （2）R-环检测 RNA通过取代与其序列一致的DNA链而与双链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA:DNA双链形成环状结构 RNA DNA + RNA DNA DNA 退火 1. 促进外源基因转录的方法 2.外源基因必须定位在正确的翻译 读码结构上 五 外源基因的表达 3. 保证有效转录的核糖体结合位点 工具酶 一、限制酶  40-60年代，科学家们就为基因工程设计好了美丽的蓝图，但是而对庞大DNA，束手无策，无从下手获得单个的基因片段，当时酶学知识已有相当的发展，但没有一个已发现的酶能够完成这样的使命。1970年，Smith Wilcox在流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)中分离纯化了Hind II，从而打破了基因工程的禁锢，为基因工程技术奠定了最为主要的技术基础。 “基因剪刀”—限制性核酸内切酶发明 限制酶的定义 限制酶(restriction enzyme): 一类专门切割DNA的酶。可识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。 “Restriction endonucleases are bacteria enzyme which cut (hydrolyze) DNA into defined and reproducible fragments . In bacteria they form part of the restriction—modification defense mechanism against foreign DNA. They are basic gene cloning tools .” 限制酶的命名与分类 （根据酶的组成、所需辅助因子及裂解DNA的方式） Ⅰ型 复合酶：核酸内切酶、甲基化酶（修饰）、ATPase 识别序列: 特异性识别15bp 切割特点: 识别位点与切割位点不一致产生片段较大、 识别后,要移动100~1000bp切割。 Ⅲ型 M.W和亚基组成类似Ⅰ型，作用方式同 I 型。 Ⅱ型 分子内部切割、特异性强、切割序列可知且固定。 限制酶命名的原则 （1）以该菌株的属名的第一个字母及种名的头两个字母组成三个斜体字母的略语表示 （2）同一种细菌若有不同菌株，则在属名种名后再加上株名 （3）若一个菌株中有几种酶时，以罗马字加以区分 （4）同一属细菌种名头两个字母完全相同，其中一个菌的酶可改用词头后的另一个字母来代替 第一个字母 该酶来源的细菌属名 大写英文字母 第二、第三个字母 该细菌的种名 小写英文字母 第四个字母 代表株名 罗马数字 同株、不同酶发现的先后次序 属 名 + 种 名 + 株 名 + 序号 （大.斜） (小.斜) (大/小.正) (正) E- Escherichia H- Haemophilus （EcoR I） co- coli （Hin d Ⅲ）in- influenzae R- RY13 d- Rd I- 该株首次分离 Ⅲ- 该株第3次分离 限制酶命名举例 限制酶的识别和切割位点 识别和切割位点： 识别： 4～6 碱基对，多具有回文结构（palindrom），少数识