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蛋白质电泳与操作 蛋白质特性 Questions： 什么是氨基酸？ 氨基酸有何结构特点？ 什么是肽？ 肽是如何形成的？ 形成肽的化学键是什么？ 什么是蛋白质？ 蛋白质的结构特点是什么？ 氨基酸（amino acid） 含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物。是蛋白质的基本组成单位。 氨基酸的酸碱性质 氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子或偶极离子的形式存在。 兼性离子：又称为两性离子是指在同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子，因此氨基酸是两性电解质。 氨基酸的等电点：氨基酸的带电状况取决于所处环境的PH值，改变PH值可以使氨基酸带正电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数相等，即净电荷为零的两性离子状态。使氨基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的溶液pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectric point）。 多肽（polypeptide） 一个氨基酸的羟基与另一个氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键（peptide bond）。 蛋白质特性 关于电泳 电泳（Electrophoresis）：是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象。 电泳技术：利用带电粒子或者分子在电场中移动速度不同而达到对粒子或分子进行分离的技术。 电泳的相关参数 电荷：粒子或分子的电荷性质决定其在电场中的迁移方向。 分子大小：分子大小决定了在特定电场强度下一定时间内分子在介质中的迁移距离。 电场强度：电场强度决定了带电粒子或分子在电场中的迁移速度。 介质密度：介质密度决定了特定分子在其中的迁移距离，因此决定其对不同分子的分辨能力。 聚丙烯凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG） 丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵，TEMED等)作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用的浓度和交联度控制。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 利用聚丙烯酰胺形成的凝胶对大分子生物物质（如核酸、蛋白质）通过附加电场使分子不同的按照分子量大小在凝胶中得到分离。 蛋白质的聚丙烯凝胶电泳类型： 按蛋白质变性与否分为变性电泳和非变性电泳； 按凝胶浓度梯度分为不连续电泳与连续电泳； 按电泳的向性分为单向电泳与双向电泳。 蛋白质变性电泳 蛋白质变性：蛋白质的三级结构和四级结构的结合力主要是半胱氨酸之间形成的二硫键（Disulfide bond）。而蛋白质三级结构和四级结构是蛋白质的功能基础。蛋白质变性就是使二硫键打开，从而使蛋白质亚基解离和三级结构打开，使蛋白质失去生物活性，故称变性（denature）。 蛋白质变性的方法：95℃加热5分钟足以破坏蛋白质中的二硫键，但是当温度降至常温后，二硫键能够重新形成，这个过程称为复性（renature）。为了使变性后的蛋白不再复性通常使用β-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol ）或二硫苏糖醇 （Dithiothreitol ，DTT）保护自由的半胱氨酸巯基。另外，为了避免复性，通常在加热后立即放入冰浴以减少蛋白质复性的机会。 蛋白质变性电泳的方法：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） SDS原理： 蛋白质在凝胶中的迁移率主要取决于分子大小、形状以及所带电荷多少。 SDS是一种阴离子表面活性剂，在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（达到饱和的状态下，每克多肽可结合1.4g SDS），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合公式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS操作程序 蛋白质样品制备 凝胶制备 样品上样 电泳 凝胶染色 电泳结果分析 试剂： ddH2O 30%Acr-Bis(29:1) 10X Tris/Glycine