DNA的提取及性质鉴定.pptVIP

DNA的提取及性质鉴定;;一、基本原理： 1、初步分开DNP和RNP 在细胞内DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(DNP)，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(RNP)，在不同浓度的盐溶液中它们的溶解度差别很大，DNP在纯水或1mol／L NaCl溶液中溶解度较大，但在0．14mol／LNaCl溶液中溶解度很低，相反，RNP易溶解。因此，用0．14mol／LNaCl溶液可简单地初步分开DNP和RNP。;2、 从DNP中把蛋白质去除 在分离核酸中最困难的是将核酸与紧密结合的蛋白质分开，而且还要避免核酸的降解。常用的解离剂是阴离子去垢剂，如脱氧胆酸钠，十二烷基硫酸钠(SDS)，4—氨基水杨酸钠和萘—1，5—二磺酸钠等，它们具有溶解病毒、细菌的作用，可使核酸从蛋白质上游离出来，还具有抑制核糖核酸酶的作用。 另外除去核酸中的蛋白质的一个有效办法是用酚—氯仿混合液，它们可使蛋白质变性并对核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有机相和水相完全分开，减少残留在水相中的酚。在用酚—氯仿抽提核酸提取液时，还需要剧烈振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，在酚—氯仿抽提液中再加上一定量的异戊醇。 ;3、从溶液中析出DNA 核酸都溶于水，而不溶于有机试剂。利用此性质用乙醇进行沉淀提取。;1.新鲜鸡肝组织 (约1g)，浸于预冷至0℃的0.14mol／LNaCl-EDTA中，洗去其血液，剥去周围的脂肪及结缔组织。 2.将组织剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入0．14 mol／LNaCl-EDTA液7 ml，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。 3.离心，2500r／min，15 min。弃上层液体，向沉淀中再加0．14 mol／L -EDTA液混匀，离心洗涤之(如欲获取掺杂RNA较少的纯DNA时，此步离心洗涤应重复多次)。 4．经洗涤后的沉淀，加入3 m1 0.14 mol／LNaCl- EDTA，在搅拌下缓缓滴人25% SDS 0.4ml，转入匀浆器内匀浆，使沉淀悬浮均匀，再加入2mol／LNaCl 4m1，这时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆一次，使之均匀。;5．加等体积的氯仿—异戊醇8 m1，剧烈振摇10 min。将此混合液离心10000r／min，3min。上层为水液，下层为氯仿，变性蛋白质在氯仿与水层的界面上。吸出上层水液(如欲获取掺杂蛋白质较少的DNA，此氯仿振摇、离心的操作可重复多??，直至界面完全见不到变性蛋白层为止)。氯仿层液体不要废弃，可倒人收集瓶内，以便蒸馏回收再用。 6．上层水液边摇边加入等体积95％乙醇，即可见有长纤维线状DNA析出，用玻棒朝同一方向搅之，DNA纤维即粘缠在玻璃棒上，在玻璃壁上尽量将水分挤干。 7．缠在玻璃棒上的DNA纤维溶于1 m1 TE缓冲液中留作定量、电泳用。;一、本次实验鸡血\鱼白DNA粗提的原理： （一) DNA的粗提 1．细胞在低渗溶液中吸收水分，出现细胞破裂。 2．DNA不溶于酒精，溶于浓度较高的盐溶液中，且随浓度的降低溶解度降低。但细胞中某些物质(蛋白质)可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA （二) DNA的鉴定 DNA中的脱氧核糖遇酸生成ω一羟基γ酮基戊醛，再与二苯胺作用显示蓝色。蓝色的深浅与溶液中的DNA含量成正相关。;二、实验步骤（鸡血）;2、取出准备好的鸡血细胞液5～10ml注入到50ml的烧杯中，并向烧杯中加入20ml的蒸馏水，快速搅拌5min。用垫有纱布的漏斗过滤，取其滤液（或者4000转离心2分钟）。（溶胀细胞，释放DNP） 3、取物质的量浓度为2mol/L的氯化钠溶液40ml加入滤液中，用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，使其混合均匀。（解聚DNA和蛋白质？） 4、取适量蒸馏水沿烧杯内壁缓缓加入，同时用玻璃棒沿同一方向轻轻地搅拌。观察烧杯中有无丝状物出现。当丝状物不再增加时，停止加入蒸馏水。(低盐析出DNA) 5、用玻璃棒将丝状物挑起，这就是含一定杂质的DNA。 6、将丝状物放入盛有物质的量浓度为2mol/L的氯化钠溶液的试管中，用力振荡1～2min，使丝状物尽可能溶解。(DNA再溶解) 7、向上述试管中加入等体积二苯胺试剂，振荡均匀，将试管放入沸水中水浴4～5min，观察颜色的变化。（二苯胺显色） ;*;二、实验步骤（鱼白--鲤鱼的精巢）;（2）溶解ＤＮＡ：取鱼白匀浆液3ml于100ml烧杯中，取10ml的2mol/ＬＮaＣl加入烧杯中，用玻璃棒单向搅拌成溶胶状。 （3）析出ＤＮＡ粘稠物：取50mL以上的蒸馏水沿杯壁慢慢注入烧杯中，同时用玻棒单向搅拌，使冻状粘稠物缠在玻棒上。 （4）ＤＮＡ再溶解：倒掉上清液，把粘稠物放入，10ml 2mol/ＬＮaＣl注入烧杯中，用玻棒充分搅拌，使粘稠物尽量溶解，再离心取上清 (5) 提取含杂质少的ＤＮＡ：取等体