化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验.docx

附件3 化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验 Short Time Exposure In Vitro Test Method (STE) 1 范围 本方法规定了化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验的范围、试验目的、术语和定义、试验原理、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。 本方法适用于化妆品用化学原料眼刺激性的检测。 2 试验目的 预测和评价化妆品用化学原料对眼睛是否具有刺激作用或腐蚀作用。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本方法。 3.1 眼睛刺激性eye irritation 眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。 3.2 眼睛腐蚀性eye corrosion 眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。 3.3 细胞活性cell viability 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占细胞总数的百分比称为细胞活性。参数的选择及其数值取决于测定的终点和试验所用的设计方案。 3.4 相对细胞活性 relative cell viability 通过与溶剂（阴性）对照组的相关性来表达的细胞活性，对照组除了未经受试化学物质处理外，整个试验过程与试验组一样。 4 试验原理 化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用，通过检测细胞毒性指标，可反映角膜损伤的程度。试验采用体外培养的兔角膜上皮细胞（SIRC），短时暴露于化妆品用化学原料，模拟急性角膜刺激作用，通过计算细胞相对存活率来预测化妆品用化学原料引起的眼睛损伤。 5 试验材料与试剂 5.1 细胞株 采用SIRC兔角膜上皮细胞，该细胞为贴壁生长。要求：来源清晰，代数明确（25代）。 5.2 培养基 采用MEM培养基，加入10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺和适量抗生素（终浓度为青霉素50～100IU/mL，链霉素50～100μg/mL）。 5.3 溶液的配制 0.5mg/ mL噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT 50mg，溶于100 mL的磷酸盐缓冲液或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤除菌，放4℃避光保存，最好现用现配。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 0.04N酸化异丙醇：异丙醇中加入HCl使其最终达0.04mol/L。 磷酸盐缓冲液(PBS)：氯化钠9.00g、七水磷酸氢二钠0.73g、无水磷酸二氢钾0.21g，去离子水定容至1000 mL，调pH=7.2～7.4，高压灭菌。 5.4 溶剂的选择 如果受试物为水溶性物质首选生理盐水作为溶剂，若受试物不能溶解或均匀混悬于生理盐水中则可首先考虑5%的DMSO/生理盐水溶液，其次可选用矿物油作为溶剂。不能溶于或均匀混悬于上述三种溶剂的物质不适用于本方法。 5.5 受试物的浓度选择及配制 受试物选择0.05%和5%两个浓度进行检测。根据受试物理化特性选择合适的溶剂，首先配制成5%浓度的溶液或均匀混悬液，然后用5%浓度的溶液或均匀混悬液依次10倍稀释配制0.05%浓度的溶液或均匀混悬液，二者直接用于试验。受试物应在使用前新鲜配制，否则必须证实储存不影响其稳定性。 5.6 对照的选择 实验应同时设空白对照、培养基对照、溶剂对照和阳性对照。完全培养基（或不含钙镁的PBS）作为空白对照，细胞悬液作为培养基对照，0.01%十二烷基硫酸钠（SLS）生理盐水溶液作为阳性对照，溶剂对照根据不同的受试物选择合适的溶剂对照。必要时增做样品对照。 6 试验步骤 6.1 受试物分组 试验时，受试物组根据其理化特性选择合适的溶剂配制成5%和0.05%浓度直接用于试验，同时设0.01%SLS生理盐水溶液阳性对照组、空白对照、培养基对照和溶剂对照组。必要时增做样品对照。 6.2 细胞染毒 6.2.1 复苏细胞。 6.2.2 接种细胞于含10%胎牛血清的MEM完全培养基中，每天观察细胞生长状态，一般5～6天细胞生长至融合状态。 6.2.3 用胰酶-EDTA消化细胞，收集细胞于离心管中，800～1000转/分钟离心5min，重新悬浮细胞于培养液中。 6.2.4 调整细胞浓度为3×104/mL，按每孔200μL细胞悬液接种于96孔板（6000个细胞/孔）中，约4天后染毒；或调整细胞浓度为1.5×104/mL，按200μL/孔接种于96孔板（3000个细胞/孔）中，约5天后染毒，染毒前一天换液。 6.2.5 上述培养的细胞融合度达80%以上时暴露于200μL5%和0.05%受试物溶液，染毒5min，每个样品做3个复孔，同时空白对照、培养基对照、溶剂对照和阳性对照做相应的处理。染毒图示见图1。 PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS PBS 空白对照 溶剂对照 S1-0.05 S2-0.05 S3-0.05 S4-0.05 S5-0