化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽反应试验.docx

附件6 化妆品用化学原料体外皮肤变态反应： 直接多肽反应试验 In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) 1 范围 本方法规定了化妆品用化学原料体外皮肤变态反应：直接多肽反应试验的范围、试验目的、定义、试验的基本原理、试验材料与试剂、试验步骤、数据处理、试验成立条件、结果判定标准和注意事项。 本方法适用于单一组分(定量组成的物质，且其中一种主要成分含量至少80%（W/W）)化妆品用化学原料或已知组成成分的多组分(定量组成的物质，且其中一种以上成分含量大于等于10%，小于80%)化妆品用原料潜在致敏性的评价。 2 试验目的 确定化妆品用化学原料对皮肤是否可引起变态反应。 3定义 3.1 多肽消耗百分比Percent Peptide Depletion 与溶剂对照相比，受试物消耗多肽的程度。 3.2 共洗脱Co-elution 受试物在220nm处吸收显著，并与多肽有同样的保留时间。 4 试验原理 有致敏性的受试物与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽模拟的皮肤蛋白共同孵育，导致多肽量减少。测定多肽量，计算多肽消耗百分比，从而判定受试物是否具有皮肤致敏性。 5 试验材料与试剂 5.1 多肽片段与纯度 半胱氨酸多肽：Ac-RFAACAA-COOH，纯度范围：90%—95%。 赖氨酸多肽：Ac-RFAAKAA-COOH，纯度范围：90%—95%。 5.2 阳性对照与受试物的配制 试验当天配制阳性对照和受试物溶液，浓度均为100mmol/L，阳性对照为纯度90%以上肉桂醛。 溶剂选择：乙腈、水、乙腈/水(V:V=1:1)、异丙醇、丙酮、丙酮/乙腈(V:V=1:1)，以及其他不影响肽稳定性的溶剂。若仍不溶解，依次可尝试使其溶解于300μLDMSO中，并用2700μL乙腈稀释；或溶解于1500μLDMSO，并用1500μL乙腈稀释。 5.3多肽贮备液的配制 5.3.1 半胱氨酸多肽贮备液：称取适量半胱氨酸多肽，用pH7.5的磷酸盐缓冲液配制成0.667mmol/L的溶液。 pH7.5磷酸盐缓冲液：取0.1mol/L磷酸二氢钠溶液18mL与0.1mol/L磷酸氢二钠溶液82mL混合，测定pH值，应在7.5±0.5之间。若偏酸性，加入0.1mol/L磷酸氢二钠溶液进行调节。若偏碱性，加入0.1mol/L磷酸二氢钠溶液进行调节。 5.3.2 赖氨酸多肽贮备液：称取适量赖氨酸多肽，用pH10.2的醋酸铵缓冲液配制成0.667mmol/L的溶液。 pH10.2醋酸铵缓冲液：取醋酸铵1.542g，加水200mL溶解，用氨水调节pH值至10.2。 5.3.3 多肽标准溶液的配制 稀释溶剂A：含20%乙腈的pH7.5磷酸盐缓冲液；配制方法：2mL乙腈加8mL pH7.5磷酸盐缓冲液。 稀释溶剂B：含20%乙腈的pH10.2醋酸铵缓冲液；配制方法：2mL乙腈加8mL pH10.2醋酸铵缓冲液。 半胱氨酸多肽标准溶液配制方法见表1，赖氨酸多肽标准溶液配制方法见表2。 表1 半胱氨酸多肽标准溶液配制方法 剂量 体积 单位 TA 体积 单位 溶剂 终浓度(mmol/L) 1 1700 μL 半胱氨酸贮备液 300 μL 乙腈 0.5670 2 1 mL 1 1 mL 稀释溶剂A 0.2835 3 1 mL 2 1 mL 稀释溶剂A 0.1418 4 1 mL 3 1 mL 稀释溶剂A 0.0709 5 1 mL 4 1 mL 稀释溶剂A 0.0354 6 1 mL 5 1 mL 稀释溶剂A 0.0177 7 NA NA NA 稀释溶剂A 0 表2 赖氨酸多肽标准溶液配制方法 剂量 体积 单位 TA 体积 单位 溶剂 终浓度(mmol/L) 1 1700 μL 赖氨酸贮备液 300 μL 乙腈 0.5670 2 1 mL 1 1 mL 稀释溶剂B 0.2835 3 1 mL 2 1 mL 稀释溶剂B 0.1418 4 1 mL 3 1 mL 稀释溶剂B 0.0709 5 1 mL 4 1 mL 稀释溶剂B 0.0354 6 1 mL 5 1 mL 稀释溶剂B 0.0177 7 NA NA NA 稀释溶剂B 0 5.3.4 液相待测溶液的配制 按下表格制备液相待测溶液：每个平行3份，配制方法见表3。 表3 液相测试溶液的配制 1:10 半胱氨酸多肽 （0.5mmol/L多肽，5mmol/L受试物） 1:50 赖氨酸多肽 （0.5mmol/L多肽，25mmol/L受试物） 总量 溶剂 总量 溶剂 750 μL 半胱氨酸多肽贮备液 （或受试物对照：pH7.5磷酸盐缓冲液） 750 μL 赖氨酸多肽贮备液 （或受试物对照：pH10.2醋酸铵缓冲液） 200 μL 乙腈 250 μL 100