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烟草瞬时转化 注射 选5-6周烟草（除叶子外一般有8-10片伸展叶片），选择生长状态较一致的烟草，注等位叶。 摇菌（饱和与否影响不大，一般2周内活化的板子摇15-20h），集菌后用烟草转化液重悬，分别调OD600到0.8以上，再准确计算所加入的量。之后，将要共注的菌按比例混合。参考：1.2ml总体积：300ul P19 + 4ul Luc + 1启动子：Gus + 10转录因子。混好后摇匀，静置1h。 注射前再混匀，空载体做的对照一定要与样品注同一叶片。 取样及测Gus、Luc 一般用打孔器在注射部位取4-8片（视Gus值而定），取后立即投入液氮中。取后可于 -80℃保存。 磨样：样品磨碎后加1×CCLR，一般300ul/样品。之后12000rpm，10min，取上清。此上清再离心一次，即可用于测 GUS 和 LUC。 测Gus：先准备2倍样品于EP管中，每管加950ul反应终止液。分别标上n-0/n-10.再准备等于样品个数的EP管，加450ul反应液，并置于37℃冰浴。取50ul上清加入反应液中，立刻取50ul出来加入反应终止液作为零点。待反应10min后再取50ul，加入反应终止液中。 注：（1）反应体系一般450ul+50ul，足够能测到Gus，一般不必调，这里450ul反应液中的底物对于50ul中的酶来说是过量的。 （2）做新的启动子时需确定合适的反应时间。一般取过零点之后，再反应10min，20min，30min，并取样最终选取的时间应处于Gus值的线性范围内。 4、测Luc：一般50ul反应底物+10ul上清测。先取空管加入50ul底物，之后，加10ul上清，吹吸十几次立刻置于仪器中测量，测量值大概在106-108数量次。 注：测量Gus的反应做完后，应立即测Luc值（避免测完Gus后，冻于-80℃之后再测Luc），之后再测Gus值。（含有Gus反应产物的终止液可于4℃保存2d以内）。 计算：以Gus：450+50，5ul测Gus；Luc：50+10，10ul测Luc 的体系为例（a代表测得的Gus值，b代表测得的Luc值） Gus/Luc=（a*2*6）/b’（其中b’=b/107） 溶液的配制; 1、1×CCLR：100ml Tris·phosphate（PH7.8） 0.30285g Tris，phosphate调PH7.8 DTT 200ul 1M DTT 1，2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tetroacetic acid 0.07287g TritonX-100 1ml 加甘油 2、反应终止液：0.2M Na2CO3 10.6g无水Na2CO3 定容至500ml（ddH2O，量筒） 3、Gus反应液：2mM MUG 4、Luc底物：promega的E4550 转化液： 0.1M As 200uL，1.2M MES 5mL，1M MgCl2 1mL， 补水至100ml。