基因治疗专题知识讲座课件.ppt

2．重组逆转录病毒的制备 Ψ- LTR LTR ψ Neo LTR LTR ψ Neo Target gene LTR LTR gag pol env 形成假病毒,出芽释放到细胞外 逆转录病毒载体 重组逆转录病毒载体 转染进包装细胞,整合后转录成RNA 重组逆转录病毒的RNA被病毒蛋白包装 包装细胞已整合有缺失ψ的逆转录病毒基因,可产生病毒的结构蛋白 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 1．逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞 靶细胞的最基本要求: 细胞表面具有逆转录病毒相应的受体 最常用作基因治疗的靶有： 骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包括所有的肿瘤细胞 2．基因转移的方法与途径 ex vivo 分离培养宿主细胞,离体转移基因,效率高，但大多人体组织细胞原代培养比较困难。 in vivo 重组逆转病毒载体直接注射的途径主要有： ①采用静脉注射途径 ②直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中 ③直接将表达载体， 3．重组逆转录病毒靶向基因转移 ①重组逆转录病毒前病毒整合位点的靶向性 大多数前病毒的整合作用是随机的，对DNase I超敏区域和转录活化区域的整合是具有优先整合的倾向性。在肿瘤中前病毒优先与细胞原癌基因和染色体脆性位点整合。 ②通过基因转移的方法与途径限制受感染细胞 ex vivo:被感染的靶细胞被预先选择，细胞靶向性能够很好地实现 in vivo:将重组病毒注射到特定的组织器官或其腔体内，以达到较好的组织细胞选择性基因转移的目的，如进行肿瘤实体内注射，使重组病毒主要感染肿瘤细胞。 ③病毒感染水平的限制 利用逆转录病毒对人类细胞的某些亚群具有限制性的亲嗜性。如HIV和HTLV-1 ④基因转录水平的限制 在逆转录病毒载体中导入具有基因表达调节作用的序列利用α-甲胎蛋白基因的肝组织特定性调节成分与TK基因相连 5‘LTR ψ Neo Ampr oriE 3‘LTR 插入外源cDNA 5‘LTR ψ Neo Ampr oriE 3‘LTR cDNA ψ SLTR SLTR 转录 g p e mRNA ψ mRNA 病毒蛋白质 包装 完成假病毒颗包装，分泌到包装细胞培养上清液中。 逆转录 感染靶细胞 前病毒 前病毒插入 外源基因 转录 mRNA 翻译 蛋白质 G418 筛选 逆 转 录 病 毒 载 体 转 染 靶 细胞的基本过程 转染包装细胞，转录出RNA （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题 1．产生野生型病毒 存在有复制能力的野生型病毒，主要来源于载体ψ和不含ψ序列的辅助病毒重组成野生型病毒 2．逆转录病毒载体插入的破坏性 逆转录病毒载体携带的基因在受体细胞染色体上的基因组合是随机的。与临近基因相互作用,可能激活癌基因，灭活抑癌基因或破坏细胞生长的必需基因。 3．污染问题 由于病毒的感染性和寄生特性，使现在约85%基因治疗临床项目采用病毒载体。但是病毒载体存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特异性差，制备复杂及费用较高等不足。所以人们愈来愈重视非病毒法的研究。 非病毒载体的本质是将基因治疗中基因看作为药物，然后从药剂和药理学的角度如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。基因作为药物发挥治疗作用的关键问题是导入的靶向性，表达的有效性和可调控性。 二.非病毒载体 转基因的非生物学方法 非病毒载体优缺点 优 点 缺 点 1.不需包装细胞，制备易、省时、滴度也不受限制，并且可对质粒或其他形式核酸进行快速分析； 2.对基因大小或核酸类型不限； 3.免疫原性低，急性毒性小，对受试者比较安全； 4.可具有特异靶向性，并能转移至非分裂期细胞并有效表达； 5.制备方便且重复性好，具有完全人工合成和大规模生产可行性，因此较简单和廉价。 1.转移效率较病毒载体低。 2.基因表达持续时间短； 3.许多问题仍需求助病毒或病毒成分解决。 1.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸→共溶于氯仿→制备成双层磷脂的封闭囊泡→超声波处理→将待转移外源基因DNA包入→制备成脂质体/质粒DNA复合物→利用其能与细胞膜融合的特性，可将质粒DNA转入细胞中。 2.优点 脂质体作为载体可以携带各种DNA片段，且在转移途中保护基因不被核酸酶降解。 3.缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。 （一）脂质体介导的转移方法 1．阳离子脂质体 由带正电荷的脂类如四胺基去污剂、胆固醇阳离子衍生物、二酰基甘油和多胺的脂类衍生物和中性辅助脂类如二油酰基磷脂