第3章抗体制备.pptVIP

七、基因工程抗体的应用 用于肿瘤的治疗 肿瘤的影像分析 抗感染作用 细胞内抗体 用于临床诊断 * 六、单克隆抗体的特性 高度特异性 高度均一性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 细胞毒作用较弱 对环境敏感性 七、单克隆抗体的应用 临床检验诊断试剂 蛋白质的纯化 肿瘤的导向治疗 放射免疫显像技术 光学显微镜下正常细胞与被侵染细胞比较 图1 正常 vero细胞 图2 风疹病毒侵染后的细胞 细胞融合技术 细胞融合技术是20世纪60 年代创立的, 它是指在一定条件下，将两个或多个细胞融合在一个细胞的过程，细胞融合又称细胞杂交。 细胞融合的最初变化，是细胞在促融因子的作用下，出现凝集现象，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞，现在不仅微生物、动物、植物种内或种间可以杂交,而且微生物、动物、植物细胞之间也可以杂交，可促进基因重组，对遗传育种、选育优良品系，以获得高产优质的品种具有重要实践意义。 融合过程示意图 细胞融合的方法 生物学法 采用病毒促进细胞融合,如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒和一些致癌病毒等均能诱导细胞融合。 化学融合剂法 20世纪70年代以来,采用的化学融合剂包括PEG、二甲亚砜、甘油醋酸酯、油酸盐及磷脂酰丝氨酸等脂类化合物。在Ca2+在存下皆可促进细胞融合。 电处理融合法 当细胞处于电场中,细胞壁两面产生电势, 由于细胞膜两面相对电荷正负相吸,使细胞膜变薄,随着外加电场强度升高,膜电场增强,当膜电势增强到临界电势时,细胞膜处于临界膜厚度,导致发生局部不稳定和降解,从而形成微孔。 融合子的筛选 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别：若一方细胞大,另一方细胞小,则大、小细胞融合的就是杂合细胞;若一方细胞基本无色,另一方为绿色,则白绿色结合的细胞是杂合细胞;如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征,则可作为识别杂合的标。 (2) 互补法筛选杂合细胞：遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。如甲细胞株缺外源激素A不能生长,乙细胞株需要提供外源激素B才能生长,则甲株与乙株融合,杂合细胞在不含激素A、B的选择性培养基上可能生长，这种选择类型称生长互补。 (3) 用采细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体：进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性和随机扩增多态性分析,以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。 单克隆抗体制备过程 图6 融合细胞后第四天细胞生长情况 图7 单克隆细胞生长情况 3天 7天 10天 14天 16天 第五节 基因工程抗体及应用 基因工程抗体（genetic engineering antibody）又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。 一、人源化抗体 人源化抗体(humanized antibody) 是指利用基因克隆及DNA重组技术对产生鼠源McAb的杂交瘤细胞内抗体基因进行改造，使其分泌的McAb中大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既保留了亲本鼠McAb的特异性和亲和力，又降低了其异源性，以利于临床应用。 人-鼠嵌合抗体（human-mouse chimeric antibody） 是利用DNA重组技术，从杂交瘤细胞中分离出鼠源McAb功能性IgV区基因，与人IgG C区基因连接成嵌合基因后， 插入适当的表达载体中，构建人-鼠嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞中表达的抗体。 为进一步降低抗体的免疫原性，人们应用基因工程技术将鼠源McAb中互补决定区(complementarity determining region，CDR)移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，即为CDR植入抗体。 二、小分子抗体 小分子抗体是指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。 优点表现为:分子量小、 可在大肠杆菌等原核细胞中表达、免疫原性要比原来的McAb弱得多、不含Fc段有利于作为靶向药物的载体、半衰期短、周转快有利于放射免疫成像检查肿瘤。 1.抗原结合片段(Fab) 由一条完整的L链和约1/2的H链组成，具有与完整抗体相同的抗原结合特性，但只能结合一个抗原表位。 2.可变区片段(Fv)和单链抗体(ScFv) Fv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能性片