第三章蛋白质的通性纯化与表征.pptVIP

第三章 蛋白质的通性、纯化与表征;蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳;P;蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 ;蛋白质的胶体性质;蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 ;加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 2. 加有机溶剂 加重金属盐 加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。;在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和条件有机溶剂沉淀法等。;在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、常温有机溶剂、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。;一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。;反应名称 ;大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大???数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 初步定量，若精细定量用考马斯亮蓝染色;分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度 依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性 若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整 难度大，迄今几百个蛋白质的单晶（单晶的天然结构都没有发生变化）;（一）盐析与有机溶剂沉淀： 盐溶 盐析： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 ;常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。;分段盐析： ;2. 有机溶剂沉淀蛋白质： ;（二）电泳：;电泳;自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 （3）双向电泳;4）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。;等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。分离同工酶;SDSPAGE中SDS的作用： 阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态 屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷 使得蛋白质的形状趋于一致;（三）层析：;凝胶过滤分离蛋白质;（四）超速离心：;蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。;蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系;酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶促反应速率;酶的纯度： 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）