实验七-黑曲霉发酵柠檬酸-.pptVIP

实验一 柠檬酸发酵及其控制 实验目的 了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理； 柠檬酸发酵的发酵条件 掌握发酵过程步骤 基本原理 1.柠檬酸结构式： 柠檬酸分子式：C6H8O7 2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。 用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。 2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O 柠檬酸发酵的条件 1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）； 孢子培养基 ：要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，所以营养不要太丰富； 发酵培养基 ：既要使菌体能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物 ； 3、合适的pH值，黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵糖，产物以柠檬酸为主；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/m）； 5、限制重金属离子，如Mn2＋缺乏促进EMP途径畅通， 控制Fe2＋含量使顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累 。 实验步骤 菌种获得 孢子悬液制备将购买的孢子与培养液振荡数下制成孢子悬液，放置在25℃的恒温箱培养24h。 制备柠檬酸发酵培养基 原料：土豆200g，硝酸铵2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.25g，蔗糖150g，水1000ml 将上述制备的三个培养基（分别为100ml的培养液）放入高压灭菌锅灭菌，待第二天在其中两个培养基中各加入50ul孢子悬浮液，另一瓶作为对照组。 液体深层发酵在转速为200rpm旋转摇床上，30℃培养5～6天。 摇床培养 培养24h后测PH，PH=7 48h后测PH及加糖，如此持续五天左右即可 时间 菌丝形态 PH值 0h 无 7.0-8.0 24h 少，不明显 6.0-7.0 48h 少，丝绒状 4.0-5.0 72h 多，丝绒状 3.0-4.0 96h 多，小球状 3.0-4.0 发酵液预处理1取发酵液经过滤 将培养瓶中培养液过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后放入冰箱保存。 柠檬酸含量的初步测定 酸度滴定法： 将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH滴定酸度。对照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g／L)的大约数。计算公式： CNaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3C柠檬酸 = ━━━━━━━━━━━━ × 1923 × 10 ×10-3 式中 C柠檬酸――柠檬酸的浓度(g／L)CNaOH――NaOH标准溶液浓度(mol／L)V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)V滴定对照――滴定对照所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1) 本小组所得结果为： CNaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3C柠檬酸 = ━━━━━━━━━━━━ × 192 3 × 10 ×10-3 =0.832g/l  步骤： 1.20℃水浴加热 2.加碳酸钙至PH为6.0-6.5之间 3.将溶液过滤，取滤渣，用清水洗净至白色，并将滤渣放入小烧杯中 4.向滤渣中加水，85℃水浴加热 5.向烧杯中加入10%硫酸，边加边摇至反应彻底至没有气泡产生 6.将液体过滤，收集滤液，置电炉上加热煮沸浓缩即产生白色晶体，此为柠檬酸钙 柠檬酸的结晶 讨论：问题与思考 影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些？ ①菌种②发酵培养基（碳源、氮源）③纯种发酵与灭菌④无机添加剂⑤pH对微生物生长的影响⑥溶氧的影响⑦温度对微生物生长的影响