小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验(11).ppt

（六）结果评价 将各组微核率进行X2检验，判断其影响程度，还可进行剂量反应关系评价。 * 毒 理教研室 * 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验  沈阳医学院公共卫生学院 毒理学教研室 2007年4月 一、实验目的及要求 骨髓细胞微核实验，是短期致突变实验方法之一，其目的是用来检测化学物是否具有致突变作用。要求通过本实验，了解其实验原理及毒理学意义，掌握其实验方法。 原理：外来化学物干扰细胞的有丝分裂或使染色体发生断裂损伤，使细胞在有丝分裂后期受损的染色体或其片断不能及时进入细胞核，而留在细胞质中，形成大小为主核1/20至1/5的微核。骨髓嗜多染红细胞为刚刚成熟排出主核的细胞，细胞中如果有微核形成则会很清晰观察到。 毒理学意义：由于微核是骨髓细胞染色体断裂后产生，所以可用来检测化学物是否具有致突变作用。 二、实验原理及毒理学意义 器材 解剖板、手术刀片、无齿镊、眼科剪、弯头止血钳、晾片架、载玻片、玻璃染片缸、记号笔、普通光学显微镜、滤纸、干净纱布、玻璃板、胶头吸管 试剂 无菌小牛血清、甲醇溶液、10%Giemsa染液、二甲苯、75％酒精溶液 三、实验器材、试剂 四、实验方法与步骤 （一）实验动物的处理： 1、一般不用大鼠而用小鼠，体重在20－24克，雌雄均可。每组动物10只可设3－4个剂量组，同时设阴性对照组和阳性对照组。 2、染毒推途径依受试物定，选择与人时间接触方式相似，本实验选取腹腔注射。 3、染毒剂量以LD50的1/5-1/50为好，给药采取24小时间隔二次给药。 本实验采用昆明种小鼠设三个染毒组和阴性一个对照组和一个阳性对照组，连续染毒4天（或24h二次染毒），于染毒后第5天（或第二次染毒后6h）脱颈椎处死动物。取胸骨（或股骨）。 四、实验方法与步骤 （二）微核分析片准备：迅速取胸骨及部分肋骨，用刀片剔除肌肉组织及表面结缔组织，沿胸骨剪掉多余肋骨，用滤纸或纱布将胸骨擦净。取载波片，标记后，用滴管取小牛血清在载波片一端滴一滴小牛血清。剪去骨骺端，用弯止血钳将骨髓挤至盛有一滴小牛血清的玻片上，混匀，用推片将其推成薄厚均匀的片子、自然干燥。 （三）固定：片膜干后用甲醇固定15min，晾干。 （四）染色：干燥后用吸管吸取10%Giemsa染液滴满载玻片，染色10-15min。染色完毕，自来水冲洗载波片背面，干后镜检。 四、实验方法与步骤 （五）结果观察与计算: 先于低倍镜下选择细胞分布均匀、染色均匀，细胞无损区域，再在油镜下计算500个嗜多染细胞的微核率。 微核的辨认：微核大多数呈圆形，单个的，边缘光滑整齐，嗜色性与核一致，吉姆萨染色厚呈兰紫色或灰兰色，偶尔有椭圆形，肾形，马蹄铁形，环形。一个细胞中出现两个或更多的微核，仍按一个计算。 微核出现率％＝微核出现个数/细胞数×100 四、实验方法与步骤 1、胸骨必需分离干净，使背景清晰。 2、制片不宜过薄或过厚，推片时成30度角即可。 3、染色完毕，自来水冲洗载玻片背面，以防膜脱 落。 4、观察记数微核时要排除人为异物，如骨髓中嗜 碱性颗粒。 五、注意事项 图1 正常的嗜多染红细胞 A 示两个微核 B 示两个微核 C ．示多个微核 D ．示一个微核 图2 微核的嗜多染红细胞 A,B,C,D