DNase B基因亚克隆 定点突变及目图的蛋白的高效表达和纯化.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘要摘要， 摘要 摘要， DNase B是A组乙型溶血性链球菌(GAS)的一种分泌蛋白，序列高度保守，几乎 存在于所有GAS中，Anti—DNase B检测可作为GAS感染引起的疾病的最佳诊断检测方 法。然而DNase B的纯化工艺复杂，获取成本昂贵，因而无法满足大量临床诊断检测 的需要。本课题研究工作的目的在于：通过基因工程的途径构建DNase B原核表达载 体，并获得DNase B高效表达。以寻找低成本、大批量的获得抗原性较强的重组DNase B的方法，为GAS诊断检测试剂和疫苗的研制打下坚实的基础。 本课题研究设计了获得重组DNase B蛋白的两条实验技术路线： 实验技术路线1：运用PCR技术，从质粒pmnl8一T—DNase B中扩增出0．5 kb截短的 nNase B基因片段，将其亚克隆构建新的原核表达载体pET一28a(+)一DNase B，经菌落 PCR和酶切鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导其目的蛋白(约22kd) 得到了表达。Western-blotting试验结果表明：菌体表达的DNase B蛋白能与GAS感 染患者的强阳性血清发生特异性的免疫反应。但实验技术路线l获得目的蛋白表达量 较低。 实验技术路线2：采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM)，对DNase B活性位点的 碱基序列进行突变，获