BMP1基因在动物卵泡发生指过程中的表达模式及功能的初步研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docx

的开放读码框，编码989个氨基酸，蛋白分子量为111．5 的开放读码框，编码989个氨基酸，蛋白分子量为111．5 kDa，等电 点为7．08。序列相似性分析结果显示水牛BMPl基因与牛、绵羊、猪、 人和小鼠BMPl基因的核苷酸序列相似性分别为99％、98％、93％、 91％矛11 89％，氨基酸相似性分别为99％、97％、96％、95％矛11 95％， 进一步构建系统进化树表明BMPl基因在动物进化过程中具有高度 的保守特性。蛋白结构域分析显示水牛BMPl基因具有显著的 HELGHVIGFWHE锌离子结合域和保守的Met—tum SIMHY区，含有 一个前蛋白区，一个锌离子结合区、五个CMB和两个EGF．Like功 能区，与其他物种BMPl基因的结构域相同或相似，成功克隆了一种 水牛物种的新型金属蛋白酶。 2．BMPl基因在水牛卵泡发生过程中的表达模式研究 首先通过实时荧光定量PCR(QRT-PCR)和Westem Blotting分 析了BMPl基因在水牛不同组织器官中的表达模式及规律。结果显 示，BMPl基因在水牛胎儿时期不同组织中都有表达且差异显著 (氏O．05)，其中在心脏中表达最高，卵巢和睾丸次之。此外，Western Blotting结果发现，BMPl基因以不同剪切体的形式存在于水牛不同 的组织当中。分离不同直径的水牛卵泡，QRT-PCR检测结果显示， BMPl基因在卵泡中的表达呈现随着卵泡直径的增大而逐渐升高的 趋势，在3~4．5 mm直径卵泡中表达量最高，且不同直径卵泡间BMPl 基因的表达差异显著(尸O．05)。免疫组化分析结果显示，BMPl基 因从水牛胎儿时期的卵巢，以及到性成熟之后的水牛的卵巢中的不同 发育时期的卵泡中都有不同程度的表达，并主要表达于卵母细胞和颗 万方数据 粒细胞中。免疫荧光检测结果显示，BMPl基因特异性的定位于颗粒 粒细胞中。免疫荧光检测结果显示，BMPl基因特异性的定位于颗粒 细胞中和卵母细胞的膜上。QRT-PCR检测结果发现，BMPl基因在水 牛成熟后COCs(卵丘卵母细胞复合体)和卵母细胞中表达量高于成 熟前，且BMPl基因在COCs中的表达显著高于裸卵(氏O．05)。 3．BMPl基因调控体外培养水牛颗粒细胞生长和卵泡发生的机 制研究 在水牛颗粒细胞培养液中添加不同浓度的BMPl重组蛋白和 BMPl抗体，以研究BMPl基因对颗粒细胞增殖以及相关因子表达变 化的影响。结果显示：BMPl基因在体外培养水牛颗粒细胞中的表达 随着培养时间的延长而显著增加(P0．05)，在体外培养96 h时达到 最高。添加BMPl重组蛋白(25 ng／mL)显著促进颗粒细胞的增殖 (氏O．05)，提高颗粒细胞的S期细胞比例，并能够抑制颗粒细胞的 凋亡(氏O．05)。BMPl重组蛋白(25 ng／mL)还可以显著上调TGF．13 信号通路中配体BMP2、BMP4、BMP6、BMPl5、GDF9和TGF．131．3 等基因，受体如BMPR．IA、BMPR．IB、BMPR．II和TGF．13R1．3等基 因(尺O．05)，以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad4、Smad5等 基因的表达(尺O．05)。此外BMPl重组蛋白(25 ng／mL)可以显著 抑制三大细胞凋亡信号通路如线粒体通路如Cytochrome C、Apafl， 死亡受体通路如TNF0【、TNFRl、Fas、FasL等，内质网通路如Chop、 Bax等促凋亡相关基因的表达，以及抑制Caspase家族Caspase．3、 Caspase一8、Caspase-9和Caspase一12的表达(尸O．05)。进一步研究表 明，BMPl重组蛋白(25 ng／mL)还显著上调与卵泡选择和优势化相 万方数据 关基因如VEGFRl、VEGFR2、PAPP．A、IGF．II、IGF．IR、IGF．IIR 关基因如VEGFRl、VEGFR2、PAPP．A、IGF．II、IGF．IR、IGF．IIR 等基因的表达(氏O．05)，而添加BMPl抗体得到了相反的结果，并 且随着抗体浓度的增3H(0-400 ng／mL)，各基因的表达显著下调或者显 著上调(尸O．05)，并显示出剂量依赖效应。 4．BMPl基因在猪卵泡发生及早期胚胎发育中的表达模式和功 能的初步研究 首先采用QRT-PCR分析了BMPl基因在猪不同直径卵泡中的表 达规律。结果显示，BMPl基因在1～2 mm直径的卵泡中表达量最低， 在4．5～6．5 mm直径的卵泡中表达量最高，并随着猪卵泡直径的增大 其表达量逐渐上升，且差异显著(尸0．05)。免疫组化分析结果显示， BMPl基因在猪不同发育时期的卵泡中，从初级卵泡到格拉夫氏卵泡 中都存在不同程度的表达，并主要表达于卵母细胞