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浅谈PCR仪温度校准的必要性及方法 PAGE PAGE 1 ———————————————————————————————— 作者： ———————————————————————————————— 日期： PAGE 5 浅谈PCR仪温度校准的必要性及方法 朱晨彬 ，朱毅晨，姚丽芳，张丽萍，陈宇，朱学平 （上海市计量测试技术研究院） 摘要：本文分析了PCR仪使用的现状及其进行温度校准的必要性。提出了PCR仪温度校准的方法和校准项目（温度准确性，温场均匀性，升降温速率，最大超调温度）以及数据处理方法，并分析了每一校准项目的重要性。 关键词：PCR仪，温度校准，温度准确性，温场均匀性，升降温速率，最大超调温度 引言 PCR是聚合酶链反应(polymerase chain reaction)的简称，是在短时间内体外大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。自动完成聚合酶链反应，提供DNA 扩增的温度条件而设计的仪器称为PCR仪。 PCR仪主要用于DNA片段的放大，可将DNA分子或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在这过程中主要是3个特征温度循环： 高温变性：把样品加热至90～95℃让DNA模板变性变成单链。 低温退火：让样品的温度迅速下降至50～65℃,引物就可以结合到模板上去。 适温延伸：让样品的温度上升至70～75℃,DNA聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。 因此，在PCR反应过程中对温度控制的要求很高，良好的温度控制是PCR仪质量好坏的关键。 二、PCR基因扩增仪校准的现状 PCR仪的控温精度、升降温速率以及温场的均匀性等直接影响DNA片段扩增的结果。PCR仪经使用后，其温度传感器的计量特性会发生变化，作为计量设备一般须经定期校准后方能继续使用。 几乎进行聚合酶链反应试验的实验室（如基因判别、亲子鉴定、DNA个体识别）都会使用多台扩增仪以满足实验需求。而且，实验室内的基因扩增仪都是常开常用，使用频率高，很难保证其性能指标符合实验要求。各实验室对PCR仪的质量控制还停留在自检自校和依赖于厂商的售后支持。 我院于2006年编写了基因扩增仪（PCR仪）的校准规范JCJ/E111025.1/0-2006，早已开展PCR仪的温度校准项目。使用标准装置： 装置名称 性能 （PCR仪）校准仪 特点 加热槽温度动态实时检测 适用工况 任何工况 测温通道数 16 温度测量范围 （0-110）℃ 系统分辨率 0.01℃ 测温准确度 ±0.10℃ 采样频率 2Hz 由于需要PCR仪升降温速率较快, 故要求温度传感器的热惯性小(滞后要小)，反应灵敏。因此，校准过程使用热敏电阻作为测温传感器。标准测试程序为： 序号 温度点 持续时间 步骤1 30°C 1:00 分钟 步骤2 95°C 3:00 分钟 步骤3 30°C 2:00 分钟 步骤4 90°C 3:00 分钟 步骤5 50°C 3:00 分钟 步骤6 70°C 3:00 分钟 步骤7 60°C 3:00 分钟 步骤8 30°C 1:00 分钟 通过专用软件进行数据处理及分析，并绘制温度循环测试曲线。见图一 图一 pcr温度循环测试曲线 PCR仪温度校准的项目及必要性 一个稳定的温度循环是成功实现PCR所必需的。其中温度控制的动、稳态特性是影响PCR扩增结果正确与否的最重要因素之一, 这包括温度准确性、升降温速度、温场均匀性、最大超调温度。 （一）、温度准确性 温度准确性是PCR仪最重要的性能指标，如温度准确性低可直接造成非特异性扩增，甚至是错误的扩增结果，造成假阳性和假阴性。 市场上各家厂商考核基因扩增仪（PCR仪）性能的主要指标，一般厂家的企业指标为±0.5℃，一些性能较好的产品可以实现的温度准确度为±0.3℃。故需对PCR仪控温准确度进行测试。 校准实验平均温度的计算公式为： I—参加检测的温度探头序号；n—参加检测的温度探头的数量 （二）、温场均匀性 由于PCR仪加热器加热不均匀，导致PCR仪模块上各孔存在一定温差。造成试验结果偏差。一般PCR仪边缘点的温度低于中间区域，所以均匀性为PCR仪重要的性能指标。一般厂家的企业指标规定均匀性为±0.5℃，一些性能较好的产品可以实现的温度均匀度为±0.3℃。 校准实验时，通过选取孔板中16个特殊反应位置（如图2所示）来测量温度，并得出孔板的温度均匀性。均匀性为各个探头在同一时刻最大温度与最小温度的差值。均匀度计算公式为：tmax-tmin （t