BMSCs介导HSVTKGC开V系统联合连接蛋白CX43治疗恶性脑胶质瘤的体内外实验研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 天漳医科，i 天漳医科，i学硕士学位论文 BMSCs介导HSV_T划GCV系统联合连接蛋白CX43 治疗恶性脑胶质瘤的体内外实验研究 中文摘要 恶性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。因为它们超强的迁移能力，瘤细胞 常广泛侵袭进入正常脑组织，并可在远离主瘤床位点形成肿瘤卫星灶，而这些肿 瘤灶也成为胶质瘤难以治愈、术后复发和病死率居高不下的主要原因。因此对于 任何切实有效的治疗策略，靶向肿瘤卫星灶的治疗都是至关重要的。 与神经干细胞(NSCs)相比，骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其不受伦理学 方面的限制，来源方便，近几年更多地被研究人员采纳。实验显示，基因修饰的 BMSCs通过表达白介素2(IL-2)或干扰素13(IFN一13)，具有良好的胶质瘤趋向性的 同时，在体内、外试验中还表现出良好的抗肿瘤作用。然而，在这些实验过程中 也留下了许多相关问题，如BMSCs的肿瘤迁移特征和机制，长时间体外培养的 BMSCs的性状稳定性以及作为基因载体治疗胶质瘤的效率等。 近几年的研究表明，虽然少数报告ⅡI期临床实验效果并不满意，但单纯疱疹 病毒一胸苷激酶／更昔洛韦(HSVtk／GCV)自杀基因治疗系统从理论上仍被认为是 最有前途的胶质瘤治疗手段之一，不论肿瘤发生的分子病理机制如何， HSVtk／GCV病毒介导的酶前体药物均可产生有效的肿瘤选择性细胞死亡。上述 毒性分子还能从HSV-tk+细胞进入HSV-tk。细胞，产生所谓的杀伤“旁效应”，而 临床试验的效果不佳的重要瓶颈之一在于基因投递的效率过低；因此本研究拟利 用BMSCs的趋瘤性，将其作为HSVtk基因载体，同时为恢复多数胶质瘤细胞系 缺失的细胞间隙连接通讯，将连接蛋白CX43转染于胶质瘤细胞，以期加强旁效 应，提高自杀基因治疗疗效。 本研究分为三部分。在第一部分首先使用当前较为成熟的原代贴壁培养法获 得BMSCs，并就其表面标记抗原予以流式细胞术鉴定，结果符合BMSCs特征， 证实BMSCs培养成功；然后分别采用软琼脂克隆形成实验、血清依赖实验和流 式细胞J嗣期分析检测BMSCs的性状稳定性和生物安全性，这些结果显示长期体 外培养的BMSCs具有相对稳定的基因表型，未见其明显的恶性转化。 天津医科大学倾j‘ 天津医科大学倾j‘学位论文 第二部分在体内、外利用几个方法不同但内容相互补充的实验进行BMSCs 的胶质瘤趋向性研究。在体外模型中，包括中央柱细胞分离培养体系、Matrigel 球体共培养体系和Transwell迁移模型，从不同角度检测BMSCs的胶质瘤趋向性。 结果显示，BMSCs的胶质瘤趋向性具有普遍性，但不同的胶质瘤细胞系具有不 同的趋化能力，而且这种趋化潜能很可能来自肿瘤细胞自身外分泌的细胞因子。 在体内试验，预先建立了大鼠c6胶质瘤模型，然后将BrdU标记的BMSCs经肿 瘤对侧脑半球、颈动脉和股静脉移植接种入体内，用免疫学实验方法检测BMSCs 在肼r瘤模型内的分布情况。结果显示接种的BMSCs主要分布于肿瘤与正常脑组 织交界部位，伴随或包裹周围浸润胶质瘤细胞或游离小灶。为研究BMSCs胶质 瘤趋向性的可能机制，该部分检测了CXCR-4、MMP2、MMP9 3个与迁移密切相关 的蛋白在BMSCs中的表达。结果显示不同培养时间的BMSCs可稳定表达 CXCR4、MMP2、MMP9，并与其传代次数无关。 第三部分，以腺病毒为TK基因载体转染于BMSCs，同时转染CX43进入 C6细胞。体内、外实验结果显示细胞间隙连接通讯可有效增强Hsv叫GCv治疗 旁效应。将实验动物分为四组即C6、CX43．C6、TK．BMsc／c6和 TK-BMSC／CX43一C6组。通过MRI对前六周各组实验鼠脑胶质瘤体积检测和连 续120天动物生存期观察，发现在同一时间点CX43．C6较单纯C6组肿瘤体积要 小得多，且动物生存期明显延长，而TK—BMSC／C6和TK．BMSC／CX43．C6组无 论从肿瘤体积还是动物生存期均较以上各组显示出更好的肿瘤杀伤作用。随后在 肿瘤内部与边缘进行的细胞核增殖抗原和细胞凋亡检测均显示出 TK—BMSC／CX43／GCV治疗体系对包括肿瘤卫星灶在内的明显的胶质瘤杀伤作 用。 上述实验结果显示具有肿瘤趋向性的BMSCs作为治疗前体药物载体靶向侵 袭瘤细胞对脑胶质瘤治疗是一个有着良好应用前景的新手段。随着临床试验展 开，大量的体外扩增及修饰，良好的迁移活性和肿瘤趋向性，BMSCs的上述研 究在成体干细胞对恶性胶质瘤治疗的临床应用研究中必将发挥其重要作用。 关键同：胶质瘤，骨髓问充质干细胞，HSV-TK自杀基因治疗，CX43，旁 观者效应 TI 天津医科大学硕j 天津医科大学硕j一学位论文 A study on the effect of