BcpLH反义基因在大白菜中的转化远及其功能的分析.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 浙江大学博士学位论文BcpLH 浙江大学博士学位论文BcpLH反义基因在大白菜中的转化及其功能的研究 摘 要 大白菜(Brassica L。ssp．pekinensis(Lour,)Olsson，syn B rapa L．ssp．pekensi,)是 原产丁我国的重要蔬菜之一。在长期自然进化和人工选择的共同作用卜，形成了以储藏营养为功 能器官的叶球，这种叶球的形态多种多样。一般认为，叶球的紧实度是重要的农艺性状之～，而 叶球是由叶数不等的球叶弯曲抱裹或抱叠形成的。因此，要了解叶球的形成规律，就需要从球叶 的弯曲机制着手。现有的植物生理学研究认为，植物激素特别是IAA在叶片的弯曲上起重要作用， 将IAA合成中的色胺酸加氧酶基冈auxl车碍i哚乙醛还原酶基冈aux2转入人自菜中的实验也支持 了生理学的这一推测。何玉科实验宝利用差异筛选法从人白菜包心期攀尖组织cDNA文库中分离 得到了一个特异表达的新基因BcpLH，根据BcpLH基因的碱基序弼及推溺的蛋白质氮基酸序，B进 行同源性比较的结果，认为该基因具有双链RNA结合蛋白的结构特征。PCR表达分析显示，该 基因更倾向于在夫白菜结球前甥的球叶中优势表达，当向大白菜喷施外源激素IAA时，体内＆雎胃 的转录本含量升高了，进而推测该基因的功能与大白菜球叶的发生发育有关，并可能受IAA的诱 导。拟南芥HYLl基因也具有双链RNA结合蚩白基因的特征，其突变体的表型是叶片卷盟，井对 外源激素有异常反应。在以上基础上，为了初步获得一些该基因在大白菜中的功能信息，我“』透 过真空渗透法和花蕾注射法将反义BcpLH基因转入大白菜}u白菜(tt campestris L．ssp．chinensis (L．)Makino Lee)中，观察转化株的形态变化；对转化株施加外源激素1AA， 6-BA和ABA。了解其对这三种激素的反应，同时对上述两种原位转化方法中影响转化效率的内 于进行了韧步的研究。获得如F主要结果： (1)转化棣从出期到生殖驯，均有一系列的形态变化，土要表现在：nf片数增加、叶片颜色 加深、叶面较皱、叶片上的刚毛较多、叶片有向外卷曲的趋势、叶间距变小、抽蕉驯推迟(10 d 左右)：除大部分花器官发育正常辨，也发现个别植株的雄蕊出现退化、育性F降触现象，其中一 转化株出现了花圈式的突变，在子房内侧着生多级完全花，呈现嵌套式花发育模式。 (2)不同种类和浓度的外源激素对转化株苗期主要器官的生长有不同的作用。IAA处理后 转化株nl色变淡，nlf片外卷。转化株叶片、叶柄、F胚轴却j主根的生长对IAA的敏感性比对照低。 (3)6-BA的浓度在0．ImM以F时促进叶片的生K，低浓度的6-BA对转化株叶片细胞体积 的扩大效应小丁对照株，高浓度时刚相反。转化株叶和叶柄生长对6-BA的刺激反应敏感，而F 胚轴和根的生长对6-BA的刺激反应迟钝，即使6-BA是在高浓度下，也一直对下胚轴的生K起促 进作飕。以0．1mM为拐点，低浓度6．BA健进主根生K，高浓度妫鄢制生长。 (4)ABA对叫形指数及叶柄生长的影响住转化株平|11r转化株问表现出低浓度抑制效廊小高 摘 摘 要 浓度抑制效应强的相同趋势，但ABA对转化株叶片和叶柄生长的抑制作用强于对非转化株的抑 制作用，表现为敏感性升高了．而对转化株下胚轴及主根的抑制效应一直比较弱，似乎说明转化 株的下胚轴与主根的生长对ABA反应迟钝，敏感性下降了。鉴于转化体在整个生育期都有表酗 变化，并且对激素有异常的反应，我们认为，BcpLH可能是上游调控基因，其功能与其说与结球 相关不如说可能与激素产生或转运有关。 (5)影响真空转化效率的主要因子是花蕾发育阶段、蔗糖浓度和表面活性剂Silwet L．77的 浓度。长度在l一3 mm时的中花蕾有利于转化；其次是长度小于l mm的小花蕾，长度大于3 mm 的大花蕾未能获得转化株。在蔗糖浓度为5％及Silwet L．77浓度为O．02％的配比下，中花蕾获得 最高转化率0．96％。蔗糖或Silwet L一77浓度过低都使转化效率大幅度下降。而蔗糖浓度高于10％ 或Silwet L-77浓度高于0．1％植株则不能存活。 (6)花蕾注射法影响转化效率的主要因子也是花蕾发育阶段、蔗糖浓度和表面活性剂Silwet L，77的浓度。花蕾长度在1～3 Inrn时有利于转化，其次是大花蕾，小花蕾在转化中易受伤，难 以存活。在蔗糖浓度为5％及Silwet L．77浓度为o．02％的配比下，中花蕾获得0．56％的转化率。 蔗糖或Silwet L．77浓度过低也都会使转化效率大幅度下降，而蔗糖浓度高于10．o％或Silwet 浓度高于0 l％时，花蕾易黄化脱落。 (7)转化的反义BcpLH基因大多以单拷贝方式插入