Blue native落PAGE分离复合物方法的建立及其在膜蛋白质复合物鉴定中的应用.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 蛋白质是细胞生物功能最主要的承担者。但大多数细胞的生物学 蛋白质是细胞生物功能最主要的承担者。但大多数细胞的生物学 功能都是由蛋白质复合物而非单个蛋白质来完成，蛋白质复合物是蛋 白质在体内发挥功能作用的一种重要形式。质膜作为细胞内外物质交 换和信息交流的场所，涉及众多蛋白质的共同作用来完成这些重要的 生理功能。因而质膜蛋白质更加容易形成复合物，成为了复合物蛋白 质组学研究的热点。对蛋白质复合物尤其是质膜蛋白质复合物的鉴 定，有利于我们从整体上理解蛋白质．蛋白质相互作用网络。然而， 鉴定蛋白质复合物最主要的限制因素是蛋白质复合物的分离方法。蓝 色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue native．PAGE or BN．PAGE)技术 是分离膜蛋白质复合物强有效的工具。这项技术依靠考马斯亮蓝 G．250染料使蛋白质带上负电荷，同时采用温和的非离子型去垢剂增 溶膜样品，使膜蛋白质复合物在近似天然的状态下根据分子量大小得 到分离。在蛋白质复合物得到分离后，可以切下第一向的泳道进行第 二向SDS．PAGE，就能将各个复合物的亚基进行分离。该方法可以用 来研究膜样品中多种复合物的组成，然而在突触质膜复合物方面的研 究中却应用的很少。本实验中，我们建立并优化了Blue native．PAGE 分离突触质膜蛋白质复合物方法，并成功用于分析D．半乳糖诱导的 C57 BL／6小鼠大脑皮层中突触蛋白质表达的变化。最近研究发现， 通过连续注射D．半乳糖到啮鼠动物体内产生的糖基化终末产物 (AGEs)会导致学习与记忆功能的减退，即AGEs与神经疾病有关。在 神经疾病中出现的学习与记忆功能退化或大脑病变都可能与突触中 蛋白质的表达量的变化有关。为了评估AGEs 蛋白质的表达量的变化有关。为了评估AGEs对突触蛋白质表达的影 响，我们结合使用BN／SDS．PAGE与质谱蛋白质组学方法，比较D． 半乳糖诱导的C57 BL／6小鼠和正常的C57 BL／6小鼠大脑皮层突触 蛋白质的表达情况。首先通过不连续蔗糖密度梯度离心的方法制备突 触质膜，然后用Blue native．PAGE结合SDS．PAGE对纯化的突触质 膜样品进行电泳分离，再经胶内酶解，最后结合LC．MS／MS质谱对 各复合物的组分进行鉴定以及对诱导组与对照组进行差异蛋白质组 学分析。我们找到了一些己知的蛋白质复合物如syntaxinlB和 synaptotagmin-1，同时也发现了一种潜在的新的蛋白质复合物，即 rab3A和synaptotagmin一1。一共鉴定到了43个差异表达蛋白质，这 些差异表达蛋白质主要参与体内的神经传递、能量代谢以及信号转导 等过程。同时我们对部分感兴趣的差异表达蛋白质在Western．Blotting 水平进行了验证，结果与质谱鉴定结果一致。另外，我们检测了MDA 和SOD的活性，发现在D．半乳糖诱导的C57 BL／6小鼠中，SOD的 平均活力显著下降，而MDA水平则上升了。这些结果表明，在大脑 中AGEs的累积导致了活性氧(ROS)的生成，破坏了能量代谢以及减 弱了突触中神经传递。因此，阐明在AGEs累积过程中的蛋白质变化 将有利于我们进一步了解在神经疾病中学习与记忆缺损机制。 总之，本实验为质膜蛋白质组学研究中的膜蛋白质复合物的分离 纯化、膜蛋白质的差异分析等提供了一些方法学上的参考；证明了 Bluenative．PAGE／SDS．PAGE是一种有效地分离膜蛋白质的手段。同 时本实验在C57 BL／6小鼠大脑突触质膜蛋白质复合物方面的工作将 Ⅱ 给大脑皮层神经突触生理和病理等功能的研究以及相关的神经疾病 给大脑皮层神经突触生理和病理等功能的研究以及相关的神经疾病 分析提供有用的信息。 关键词：质膜蛋白质组，突触质膜蛋白质复合物，Blue native．PAGE， SDS—PAGE，质谱，糖基化终末产物(AGEs) m AB AB STRACT Proteins are the main bearer of cell biological functions．However， most of the biological functions of cells are performed by protein complexes rather than a single protein．One of the most important ways for proteins to exert their functions in vivo is to form protein complexes． Plasma membrane is the place of material exchange and information