人体组织学与解剖学实验指导 黄冈师范学院网.doc

PAGE PAGE 44 黄冈师范学院生物科学专业 人体解剖生理学实验教案 ——人体组织学与解剖学 授课年级： 2005级 授课教师： 吴 中 华 授课时间： 2006年 秋 实验一：小鼠内脏器官的石蜡切片的制备 [目的要求] 1．熟悉石蜡切片的制作过程。 2．掌握HE染色的基本原理和染色方法。 [实验原理] 显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细胞学等学科研究观察细胞。组织的生理，病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辩明。但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。 苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 [实验方法] 一、取材 根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜，准确，材料要避免挤压，挫伤，干枯。 所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间，地点，名称，组织部位，取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。 一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。 二、固定 动、植物的任何组织部位，要制成切片，首先用化学试剂将其固定，固定的作用在于通过固定剂，在尽量短的时间内使原生质体停止生命活动，并如同生前一样精细的保存其细胞结构，同时易于后步骤的染色所以良好的固定剂应该具备以下条件： ①迅速渗入组织杀死原生质体，在短时间内，组织内外完全固定； ②尽可能避免使组织膨胀或收缩，并且软硬合适于切片； ③增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别，同时增加媒染作用和染色能力； ④固定液同时是防腐液，使材料不致变质腐败。 三、脱水 脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。 现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。 脱水的过程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100% 脱水应逐步而不应跨越太大的进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。 四、透明 透明是用一种即能与酒精又能与包埋介质混合的液体来置换样品中的酒精，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。 其过程为： 1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。 五、渗蜡 将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60° 六、包理 组织块经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包理成蜡块以利于后边的切片，包理可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。 将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，浅埋在石蜡内，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。 至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤表明看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。 我们可以看到： ①水和酒精可以相溶。 ②酒精和二甲苯相溶。 ③二甲苯和石蜡可以相溶。因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。 ④我们看到水和二甲苯不能相溶，酒精和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。 七、切片 修块： 切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，并将这组织周围的石蜡切除，将组织修成一小块蜡块并粘在大小适宜的硬木块上，以便于固定在切片机上。 贴片： 一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带 切下的蜡带放在一干净黑纸上，用小刀根据需要切成数段，分别贴在干净载玻片上。在恒