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基因工程原理复习题思考题 5、 简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾晦 來源不同，识别的序列不同，但能切出和同的粘性末端，连接后不能被相关的陆同 时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶 (PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识別位点相同，但切点不同。) 6、 连接酶主要有哪些类型？有何界同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从宁向引进行核昔酸或脱氧核昔酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合卿识別脱氧核糖核昔酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合猶聚合的是 核糖核莒酸，在转录中起作用。 7、 试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。(传说中的网上答案) 1、 低温下长吋间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、 在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连， 应该可以人人提高平端连接的效率。 3、 足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、 平端的连接对于离子浓度很験感 5、 尽可能缩小连接反应的体积 6、 建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 大肠杆菌DNA聚合酶 Klenowfragment T7 DNA聚合酶 T4DNA聚合酶 修饰过的T7DNA聚合酶 逆转录酶 Taq DNA聚合酶 第四章 基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)； 具有合适的筛选标记； 具冇较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点(MCS)； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因「-程屮常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三人类。 这些载体均需经人工构建，除去致病某因，并赋予一些新的功能，如冇利于进行筛选的标志 基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因索有哪些? A、 化学法（CaCI2法）转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经 热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态 细胞）。 B、 电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池 屮，两极施加高压电场，在强人电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA 垂组分子便可进入细胞内。 影响转化率的主要影响因素： 1） 载体本身的性质及具空间构彖：超螺旋构象转化率最高； 2） 插入片段的人小：插入片段越人，转化效率越低； 3） 受体细胞的类型及预处理； 4） 转化方法：电击法高于化学法。 5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。 从总体上看，重组体分了的选择与鉴定方法棊木上可以分为如下几个类型： （1） 基于载体遗传标记检测法 在构建基因工程载体系统吋，载体DNA分子上通常携带了-?定的选择性遗传标记基因，转 化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化了或重组 子的初步筛选。 （2） 基于克隆DNA序列检测法 Southern Cp迹朵交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合 在适肖的滤脫上，然示通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA 片段。 （3） 基于外源基因产物检测法 如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是 显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含冃的基因的克隆子。 第五章基因的克隆一般方法 1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克降原理（至少3利J都是书上找的，口选哈， 建议必选DD RT-PCR和SSH,原因请看下题）? 1） 差减杂交（SH） 通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式來进行目的基因 分离克隆的。 2） 抑制性差减杂交（SSH） SSH的核心技术是抑制性PCR,它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结 合为一体的技术。其屮标准化步骤均等了检测子屮的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除 了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。 3） 差异显示 PCR （DD RT-PCR） 利用真核生物mRNA结尾处有POLY （A）结构，在其3端设计象5-TllGA样引物，该引物 可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机 引物（20条10-mer）,可以使不同长度的基因得到扩增。 4） DNA代表性差异分析