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检测目的基因是否翻译成蛋白质 　　具体做法是：　　第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；　　第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；　　第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；　　第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；　　第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。　　由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。 目的基因 蛋白质 小鼠体内 抗体 目的基因 受体细胞 蛋白质 抗原 抗原 杂交分子 检测目的基因是否翻译成蛋白质 ----抗原抗体杂交 ---抗原-抗体杂交 * * 现代生物科技专题 1.2　基因工程的基本 　　操 作 程 序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的表达和检测 基因工程的基本操作程序 1、从基因文库中获取 (基因序列未知) 基因文库 基因组文库： 部分基因文库－－如：cDNA文库 一.目的基因的获取 包含一种生物的全部基因 包含一种生物的部分基因 图书馆 国家图书馆 市图书馆 基因文库 基因组文库 部分基因文库 限制酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 基因组文库(Genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。 cDNA( 互补DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库 cDNA文库 (cDNA library) 反转录酶 mRNA 基因重组 cDNA 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性 从基因文库中得到目的基因的方法 2、利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术：聚合酶链式反应 目的：扩增DNA 5/ 3/ G—G T—C 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ 引物Ⅱ G—G 高温变性 低温复性 中温延伸 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 5/ 3/ 5/ 3/ 90℃-95℃ 55℃-65℃ 70℃-75℃ 过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、复性（55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR扩增仪 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ③条件：_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.等 ②原理：__________ ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸 引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 要有一段已知核苷酸序列的目的基因 PCR技术 3、人工合成 (基因比较小，序列已知) DNA合成仪 1）反转录法： cDNA (互补DNA) 蛋白质 mRNA DNA 推测 推测 DNA DNA合成仪合成仪 合成 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 二 基因表达载体的构建 基因表达载体的模式图 抗生素抗性基因 基因表达除含有目的基因外，还需要哪些元件： 启动子 终止子 标记基因 1.基因表达载体的组成 细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶是一种蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合，能催化DNA转录为RNA 启动子 终止子 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止DNA的转录 起始密码子？终止密码子？ 细胞的基因结构 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶 A G G