生物化学-第14章核酸物理化学性质—第15章核酸研究方法.pptVIP

末端终止法——Sanger 2’，3’双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。 MOV : MCB4.0\Dideoxy sequencing of DNA DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP （二）DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱 4组特异的反应如下： （1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂 （2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂 （3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基 （4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂 32P-GCTACGTA： 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG 硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG 甲酸（G+A）： *A *ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA *ACTTCGACAG 肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG 从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。 32P *ACTTCGACAG （三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个： （1）用酶特异切断RNA链： （2）用化学试剂裂解RNA （3）逆转录成cDNA 1995年K.Mullis发明。基本步骤为： 1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物 2.优化反应体系：包括适量模板、引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+ 五、DNA聚合酶链式反应（PCR） 3.选择3个温度进行热循环： 变性94℃，45－60s； 退火，根据引物的Tm ，1min； 延伸，72℃，1min。 循环 4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果 y=产物；x=扩增效率；n＝循环次数 (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的 数量满足实验需求为止。 ①模板DNA（单链） ②引物 ③DNA聚合酶（Taq） ④dNTP ⑤Mg2+ MOV:MCB4.0\POLYMERASE CHAIN REACTION 一、核酸的变性(denaturation) 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。 1. 引起核酸变性的因素 （1）温度；加热到80～100℃ （2）酸碱度改变 （3）化学试剂：尿素 、甲醛 2. 核酸变性的特点 （1）一系列物化性质也随之发生改变 ：紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变等 （2） 变性作用发生在一个很窄的温度范围内 。 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82—95℃之间 3. 影响Tm值的因素 (1) DNA的均一性 。越均一，DNA熔解温度发生在一个很窄的温度范围之内 (2) G-C之含量 。G-C对含量越多，Tm值越高 (3) 介质中的离子强度 。一般说在较高的离子强度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。 二、复性 (renaturation) 变性DNA在适当条件下，又可