第十一章 荧光分析法 Fluorometry课件.ppt

第四节 仪器 * 第十一章 荧光分析法 Fluorometry 荧光分析法 概述 1 基本原理 2 荧光定量分析方法 3 荧光分析技术与应用 4 小结 5 一、概 述 光致发光：指处于激发态的分子或原子通过发射出一定波长的光，以辐射的形式回到基态，这种能级的变化叫光致发光(辐射跃迁)。最常见的两种光致发光是荧光和磷光。 荧光（Fluorescence) 物质吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级回到基态时所发射出的光称为荧光。 一、概 述 荧光分析法（Fluorometry) 根据物质的荧光谱线位置及其强度鉴定物质并测定物质含量的方法称为荧光分析法。根据光源不同，荧光分析法可分为: X射线荧光法（X-ray fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry) 分子荧光法（Molecular Fluorometry) 一、概 述 荧光分析法与紫外-可见分光光度法的比较 吸收光谱 发射光谱 本质 一般 高 选择性 10-5~10-7g/mL 10-8~10-10g/mL 灵敏度 不同点 分子光谱 分子光谱 相同点 紫外可见 荧光 荧光分析法 概述 1 基本原理 2 荧光定量分析方法 3 荧光分析技术与应用 4 小结 5 二、基本原理 1.分子荧光光谱的产生 （1）分子能级与电子能级的多重性 单重态（singlet state): 总自旋S=0，两个电子自旋方向相反，M=2S+1=1 三重态（triplet state): 总自旋S=1，两个电子自旋方向平行， M=2S+1=3 π* 基 态 单重态 激发态 单重态 激发态 三重态 π* π* π π π 二、基本原理 （2）荧光的产生 处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径： 振动驰豫 vibrational relexation 内部能量转换 internal conversion 荧光 Fluorescence 外部能量转换 external conversion 体系间跨越 intersystem crossing 磷光 Phosphorescence ν0 ν2 ν1 ν3 ν4 a d f b c e S2* S1* S0 T1 a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光 荧光和磷光产生的示意图 ν0 ν2 ν1 ν3 ν4 ν0 ν2 ν1 ν3 ν4 ν0 ν4 ν1 ν2 ν3 二、基本原理 2.激发光谱和发射光谱 硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b) （1） 激发光谱（excitation spectrum) （2） 发射光谱 （emission spectrum) 二、基本原理 （3）荧光光谱的特点 a.斯托克斯位移（Stocks shift)：荧光发射波长总是大于激发光波长。 硫酸奎宁的激发光谱(a)和发射光谱（b) 二、基本原理 （3）荧光光谱的特点 c.荧光光谱与激发光谱呈对称镜像关系。 蒽的激发光谱和荧光光谱（溶剂：环己烷） S0 S1* ν=4 ν=3 ν=2 ν=1 ν=0 ν=4 ν=3 ν=2 ν=1 ν=0 b4 b3 b2 b1 b0 c0 c1 c2 c3 c4 ΔE4 ΔE3 ΔE2 ΔE1 ΔE4 ΔE3 ΔE2 ΔE1 蒽的能级跃迁图 二、基本原理 3.分子结构与荧光的关系 （1）荧光寿命和荧光效率 a.荧光寿命（fluorescence life time)：指除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/2时所需的时间，常用τf表示。 式中：F0 ，Ft为激发态时t=0和激发后时间t时的荧光强度。 ▲如果以ln(F0/Ft)对t作图，直线斜率即为1/ τf，由此可计算出荧光寿命。 二、基本原理 b.荧光效率（fluorescence efficiency)：它又称为荧光量子产率（fluorescence quantum yield)，就是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示。 ▲φf,max≤1 二、基本原理 3.分子结构与荧光的关系 （2）分子结构对荧光效率的影响 a.能发射荧光的物质必备的两个条件 分子一定要能吸收紫外光、可见光。 有较高的荧光量子效率。 具有吸光结构，结构中有π→π*，n→π*，而n→π*引起是弱吸收，有时不足以发射荧光，只有分子只能够存在共轭的π→π*跃迁，也就是K带强吸收时，才可能有发生荧光。 二、基本原理 b.分子结构与荧光的关系 长共轭结构。 苯 萘 蒽 λex=205nm λem=278nm Φf=